雷有玲，張　文

（1.青海省海北州門源縣北山鄉(xiāng)獸醫(yī)站，青海 門源 810300；2.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 西寧 812100）

豬偽狂犬病病毒野毒抗體膠體金免疫層析試紙條的初步應(yīng)用

雷有玲1，張文2

（1.青海省海北州門源縣北山鄉(xiāng)獸醫(yī)站，青海 門源 810300；2.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 西寧 812100）

為建立一種簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異的豬偽狂犬病病毒野毒抗體血清學(xué)檢測(cè)方法，本研究利用膠體金標(biāo)記SPA蛋白作為金標(biāo)墊，以重組gE蛋白和豬IgG分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，組裝檢測(cè)豬偽狂犬病病毒gE抗體的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條肉眼于15 min內(nèi)即可判定結(jié)果，檢測(cè)PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒的陽(yáng)性血清均為陰性，檢測(cè)PRV野毒陽(yáng)性血清的靈敏度達(dá)1∶1 280，與IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的符合率為95.31%，室溫條件下可穩(wěn)定保存6個(gè)月以上。本研究研制的PRV野毒抗體膠體金免疫層析試紙條操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，可用于PRV野毒感染的快速診斷，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

豬偽狂犬病病毒；野毒抗體；gE蛋白；膠體金免疫層析；試紙條

豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物易感的一種急性、敗血性傳染病，豬是PRV的主要宿主和帶毒者，可引起公豬不育，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，仔豬神經(jīng)癥狀、腹瀉，新生仔豬病死率可高達(dá)100%，成年豬常呈隱性感染、生長(zhǎng)性能減慢、且終身帶毒并排毒，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是預(yù)防控制PR的重要手段，目前國(guó)內(nèi)外普遍采用PRV gE基因缺失疫苗及配套的gE抗體鑒別診斷技術(shù)逐步對(duì)PRV野毒實(shí)行凈化，由于gE基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用，我國(guó)有效控制了PR的發(fā)生與流行，但近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬密集地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)PRV野毒感染的病例，PR發(fā)病率明顯上升［1-2］，故急需加強(qiáng)對(duì)PRV野毒的監(jiān)測(cè)。目前，PCR方法、熒光定量PCR方法、ELISA方法均已廣泛應(yīng)用于PRV野毒感染的檢測(cè)中［3-4］，但諸多檢測(cè)方法均存在對(duì)儀器設(shè)備與技術(shù)人員要求較高、操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長(zhǎng)（至少3 h）等缺陷。膠體金免疫層析技術(shù)（Gold immunochromatography assay，GICA）是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)，具有不需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速（一般20 min內(nèi)完成檢測(cè)）、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于廣大基層獸醫(yī)人員和基層養(yǎng)豬生產(chǎn)單位使用。鑒于此，本研究在已成功表達(dá)PRV gE蛋白的基礎(chǔ)上，將其純化后作為檢測(cè)線，同時(shí)以膠體金標(biāo)記SPA蛋白作為金標(biāo)墊，以豬IgG作為質(zhì)控線，組裝了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)豬偽狂犬病毒gE抗體的膠體金免疫層析試紙條，旨在為我國(guó)PRV野病毒感染的快速診斷提供一種操作簡(jiǎn)單、敏感、特異的血清學(xué)診斷方法。

1　材料與方法

1.1重組質(zhì)粒、菌株與血清表達(dá)PRV gE蛋白的重組質(zhì)粒pET30a-gE、表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，均由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細(xì)小病病毒（PPV）、PRV疫苗毒陽(yáng)性血清、PRV野毒陽(yáng)性血清、PRV陰性血清，均由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；臨床血清樣品464份由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室收集并保存。

1.2試劑與試劑盒His-Tag蛋白純化試劑盒為L(zhǎng)ife Technologies公司產(chǎn)品；純化的豬IgG，購(gòu)自上海易佰聚生物公司產(chǎn)品；葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）為Prospec公司產(chǎn)品；玻璃纖維、硝酸纖維素膜、吸水墊、背襯均為Millipore公司產(chǎn)品；PRV gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。

1.3重組抗原的制備與鑒定參照文獻(xiàn)［1］的方法，將pET30a-gE陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，離心收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，參照His-Tag蛋白純化試劑盒使用說(shuō)明書分離純化重組蛋白，利用考馬斯亮藍(lán)染色方法測(cè)定純化蛋白的濃度，利用SDS-PAGE電泳分析純化蛋白的純度，利用Western Blot鑒定純化蛋白的活性。

1.4膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，取100 mL超純水倒入250 mL錐形瓶中，滴加1.0%氯金酸溶液1.0 mL，置于磁力攪拌器中連續(xù)攪拌并加熱至沸騰，攪拌下快速加入1.0%檸檬酸三鈉溶液1.8 mL，此時(shí)溶液逐漸由淺黃色變?yōu)榛液谏詈笞優(yōu)槌燃t色，待溶液變?yōu)槌燃t色后繼續(xù)加熱15 min，冷卻至室溫，0.1 mol/ mL K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5左右，超純水定容至100 mL后，置于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5SPA金標(biāo)復(fù)合物的制備取20 mL制備的膠體金于50 mL小燒杯，在快速攪拌下滴加0.2 mL SPA（1.0 mg/mL），繼續(xù)攪拌30 min，加入BSA至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30 min。8 000 r/min（4℃）離心45 min，棄上清，沉淀用含0.5%PEG 20 000的0.05 mol/L PBS洗滌2次后，用2.0 mL含1% BSA的0.1 mol/L PBS重懸，置于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6膠體金免疫層析試紙條的組裝將玻璃纖維用含2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫20的0.1 mol/ L PBS封閉后，置于37℃恒溫箱，待干燥后即得樣品墊；將SPA金標(biāo)復(fù)合物噴涂于樣品墊上，真空干燥后即得SPA金標(biāo)結(jié)合墊；將豬IgG（2.0 mg/ mL）和PRV gE純化蛋白（1.0 mg/mL）分別劃線于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線和檢測(cè)線上。依次將樣品墊、SPA金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙粘貼在塑料背襯上，組裝膠體金免疫層析試紙條。

1.7判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定取100 μL檢測(cè)樣品滴于試紙條的樣品墊上，10～15 min內(nèi)判斷結(jié)果。檢測(cè)線與質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色線，檢測(cè)樣品為陽(yáng)性；檢測(cè)線不顯色，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色線，檢測(cè)樣品為陰性；質(zhì)控線不顯色，試紙條失效。

1.8交叉反應(yīng)試驗(yàn)利用組裝的膠體金免疫層析試紙條分別檢測(cè)PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒、PRV野毒陽(yáng)性血清、PRV陰性血清，確定PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條的特異性。

1.9敏感性試驗(yàn)將PRV野毒陽(yáng)性血清用滅菌PBS依次做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶ 320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560倍比稀釋，確定PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條的敏感性。

1.10重復(fù)性試驗(yàn)

1.10.1批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)選取4份PRV野毒抗體陽(yáng)性血清樣品和4份PRV陰性血清樣品，每份血清樣品平行做4個(gè)重復(fù)，用同一批次PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的批內(nèi)重復(fù)性。

1.10.2批間重復(fù)性試驗(yàn)選取4份PRV野毒抗體陽(yáng)性血清樣品和4份PRV陰性血清樣品，用4批不同批次的PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的批間重復(fù)性。

1.11符合性試驗(yàn)利用本研究組裝的PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條和IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)128份血清樣品，統(tǒng)計(jì)計(jì)算試紙條相對(duì)于進(jìn)口試劑盒的符合率，確定試紙條的準(zhǔn)確性。

1.12保存期試驗(yàn)將試紙條密封后置于室溫中，每隔30 d進(jìn)行交叉反應(yīng)和敏感性檢測(cè)，比較分析檢測(cè)結(jié)果，確定試紙條的保存期。

1.13臨床應(yīng)用應(yīng)用本研究組裝的PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)2012-2014年收集于國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的464份血清樣品，了解掌握近3年國(guó)內(nèi)PRV野毒感染抗體陽(yáng)性率，并確定PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條的臨床適用性。

2　結(jié)果與分析

2.1診斷抗原的制備與鑒定結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，重組gE蛋白以包涵體形式表達(dá)，其分子量大小為33 ku，經(jīng)His-Tag蛋白純化試劑盒純化后，純度達(dá)90%以上，濃度達(dá)1.7 mg/mL，Western Blot檢測(cè)表明，重組蛋白具有較好的反應(yīng)活性，與我們以前的報(bào)道結(jié)果完全一致［1］。

2.2交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，利用組裝的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒陽(yáng)性血清、PRV陰性血清均呈陰性反應(yīng)，而檢測(cè)PRV野毒陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明組裝的試紙條具有良好的特異性。

圖1　交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

圖2　敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，利用組裝的膠體金試紙條檢測(cè)倍比稀釋的PRV野毒陽(yáng)性血清，當(dāng)血清稀釋至1∶1 280時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，表明組裝的試紙條具有良好的敏感性。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果4份PRV野毒抗體陽(yáng)性血清樣品和4份PRV陰性血清樣品的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果均完全一致，表明組裝的試紙條具有良好的重復(fù)性。

2.5符合性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，利用本研究組裝的PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條和IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)128份血清樣品，IDEXX gE-ELISA試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性33份，陰性95份，而膠體金試紙條檢測(cè)出陽(yáng)性35份，陰性93份。IDEXX gE-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的33份樣品，膠體金試紙條檢測(cè)出陽(yáng)性31份；IDEXX gE-ELISA檢測(cè)為陰性的95份樣品，膠體金試紙條檢測(cè)出陰性91份，二種方法檢測(cè)結(jié)果相同的樣品共計(jì)122份，二者的符合率為95.31%（122/128），PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條顯示出了良好的準(zhǔn)確性。

表1　符合性試驗(yàn)結(jié)果

2.6保存期試驗(yàn)結(jié)果將試紙條密封置于室溫保存6個(gè)月后，檢測(cè)結(jié)果表明，其特異性和敏感性均未發(fā)生任何變化，表明該試紙條可在室溫條件下保存半年以上。

2.7臨床應(yīng)用結(jié)果應(yīng)用本研究組裝的PRV gE抗體膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)2012-2014年收集于國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的464份血清樣品，檢出陽(yáng)性62份，血清抗體陽(yáng)性率為13.36%（62/464），膠體金試紙條方法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、敏感、特異，表現(xiàn)出了良好的臨床適用性。

3　討論

近幾年來(lái)，PR在我國(guó)豬群中陸續(xù)流行，要想根除該病，除靠疫苗免疫接種外，還應(yīng)加強(qiáng)PRV野毒感染的監(jiān)測(cè)并及時(shí)淘汰隱性感染豬，才能逐步實(shí)現(xiàn)PR的凈化。因此，敏感、特異、準(zhǔn)確的PRV野毒感染診斷技術(shù)是PR凈化的關(guān)鍵。盡管本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用gE蛋白建立了檢測(cè)PRV野毒抗體的間接ELISA方法，但該方法對(duì)酶標(biāo)儀和專業(yè)技術(shù)人員的依賴性較高，限制了其在基層獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖單位中的普遍應(yīng)用。而本試驗(yàn)利用gE蛋白建立的檢測(cè)PRV野毒抗體的膠體金免疫層析試紙條無(wú)需任何儀器設(shè)備，肉眼于15 min內(nèi)即可判定結(jié)果，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，且該方法檢測(cè)PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒的陽(yáng)性血清均為陰性，檢測(cè)PRV野毒陽(yáng)性血清的靈敏度達(dá)1∶1 280，室溫條件下可穩(wěn)定保存6個(gè)月以上，與IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的符合率為95.31%。雖然該膠體金試紙條與進(jìn)口ELISA試劑盒符合率高達(dá)95%以上，但試紙條陽(yáng)性檢出率仍然偏高，究其原因可能與原核表達(dá)包涵體蛋白的非特異性反應(yīng)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)重組蛋白的純化工作，逐步提高試紙條的特異性和準(zhǔn)確性。總之，本研究研制的膠體金試紙條已具備了相對(duì)良好的特異性、敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和臨床適用性，可以用作血清中PRV野毒感染抗體的快速篩查，對(duì)于陽(yáng)性血清樣品可用其他分子生物學(xué)或ELISA方法進(jìn)行復(fù)核，這將大大縮短檢測(cè)周期，降低檢測(cè)成本，在基層獸醫(yī)工作人員和基層養(yǎng)豬生產(chǎn)單位中將具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)為我國(guó)PRV野毒感染的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種價(jià)格低廉、敏感、特異的血清學(xué)診斷技術(shù)。

［1］鄒敏，楊旭兵，鄭輝，等.2012-2013年我國(guó)部分地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（4）：1-5.

［2］占松鶴，劉華，周迎春，等.安徽省規(guī)?；N豬場(chǎng)豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（3）：124-127.

［3］張婕，李增奎.應(yīng)用PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒野毒的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：30-31.

［4］呂素芳，郭廣君，李峰，等.SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒gE基因缺失病毒株方法的建立［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（2）：38-42.

S858.28

A

0529-6005（2016）09-0035-03

2015-05-13

雷有玲（1983-），女，獸醫(yī)師，本科，從事動(dòng)物防疫及檢疫工作，E-mail：leiyouling1980@126.com