王志強(qiáng)，劉力威，李洪彬，黃宇翔，楊旭東，鄒　躍，張　軍

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)株結(jié)構(gòu)基因序列分析

王志強(qiáng)，劉力威，李洪彬，黃宇翔，楊旭東，鄒躍，張軍

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

為了研究鵝細(xì)小病毒（GPV）YAN98分離株在鵝胚成纖維細(xì)胞（GEF細(xì)胞）中的適應(yīng)及變異情況，試驗(yàn)將YAN98毒株接種至GEF細(xì)胞中并連續(xù)傳代至F21代，利用分段PCR法擴(kuò)增F21代細(xì)胞適應(yīng)毒和親本病毒F0的結(jié)構(gòu)基因序列，通過對測定序列進(jìn)行剪輯、拼接，將F21代病毒結(jié)構(gòu)基因序列與親本病毒序列進(jìn)行比對，并推導(dǎo)氨基酸差異位點(diǎn)，分析遺傳變異性。結(jié)果表明，該病毒分離株已適應(yīng)GEF細(xì)胞，并在72～96 h產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，其F21代病毒效價為105.5TCID50。F21代病毒與親本病毒F0代結(jié)構(gòu)基因中存在11個核苷酸差異，推導(dǎo)的氨基酸序列與親本病毒氨基酸序列比對差異不顯著，存在5個差異位點(diǎn)。

鵝細(xì)小病毒；細(xì)胞適應(yīng)毒株；結(jié)構(gòu)基因；序列分析

鵝細(xì)小病毒（GPV）是鵝細(xì)小病毒病的病原體，該病呈世界范圍流行，至今仍是危害養(yǎng)鵝業(yè)中最嚴(yán)重的傳染病，每年都有不同程度的流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。GPV基因組大小為5 106 bp，含有2個開放閱讀框（ORF），左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白基因，右側(cè)ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白基因，非結(jié)構(gòu)基因和結(jié)構(gòu)基因分別具有共同的羧基端及終止密碼子［1-3］。GPV的VP基因是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的成分，同時與病毒的毒力及致病性密切相關(guān)。本試驗(yàn)將GPV YAN98毒株接種在鵝胚成纖維細(xì)胞（GEF）中連續(xù)傳代至F21代，得到具有明顯細(xì)胞病變穩(wěn)定的細(xì)胞毒。通過觀察細(xì)胞病變和測定細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50），確定YAN98病毒在GEF細(xì)胞中的適應(yīng)性。在此基礎(chǔ)上，對F21代細(xì)胞適應(yīng)毒和親本病毒F0代結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到結(jié)構(gòu)基因全長，并進(jìn)行序列的測定和比對，分析YAN98毒株在GEF細(xì)胞中的適應(yīng)性及適應(yīng)細(xì)胞后的變異情況，以期為分析鵝細(xì)小病毒在GEF細(xì)胞中的增殖及適應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1毒株及試驗(yàn)動物鵝細(xì)小病毒YAN98分離株，是黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所第一研究室1998年自依安縣病例中分離鑒定的強(qiáng)毒株，經(jīng)鵝胚傳至15代弱化。12日齡鵝胚及1日齡雛鵝均為鵝細(xì)小病毒非免疫本地白鵝卵孵化，鵝細(xì)小病毒瓊擴(kuò)（AGP）抗體陰性。

1.2引物設(shè)計與合成參考Zadori等［4］發(fā)表的鵝細(xì)小病毒B株的基因序列，應(yīng)用Oligo6軟件設(shè)計覆蓋鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的2對特異性引物。1號引物為VP3基因引物，VP3基因片段長度為1 605 bp，設(shè)計擴(kuò)增長度為1 663 bp：2號引物為VP1-VP3非重疊區(qū)基因引物，VP1-VP3非重疊區(qū)基因片段長度為594 bp，設(shè)計擴(kuò)增長度為880 bp。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

表1　GPV結(jié)構(gòu)蛋白基因PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度

表2　GPV結(jié)構(gòu)基因PCR反應(yīng)條件

1.3病毒在細(xì)胞中的適應(yīng)及PCR檢測取20 h內(nèi)形成完整單層的鵝胚成纖維原代培養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液洗2次，吸出洗液，接入傳代毒種1 mL/中方瓶，37℃吸附培養(yǎng)1 h，棄去病毒吸附液，加入含8%FBS的新鮮DMEM營養(yǎng)液10 mL/中方瓶，同時設(shè)空白細(xì)胞對照兩瓶，37℃恒溫靜止培養(yǎng)5 d。反復(fù)凍融3次，將GEF細(xì)胞吹下，連同上清液一起，按上述方法接種病毒，連續(xù)盲傳，以提取的F1、F2、F3代細(xì)胞毒及空白對照的DNA為模板，以分別設(shè)計合成的2對引物作為VP3與VP1-VP3非重疊區(qū)基因的引物，利用PCR法檢測病毒。各片段PCR反應(yīng)條件見表1-2。按下列順序加入各溶液建立50 μL PCR反應(yīng)體系：2×PCR Taq Mix，25 μL：上游引物，2 μL：下游引物，2 μL：模板DNA，2 μL：ddH2O，19 μL。擴(kuò)增完成后的PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄結(jié)果。

1.4TCID50的測定24孔板鵝胚成纖維細(xì)胞系1～3代細(xì)胞培養(yǎng)，20 h形成70%單層時用于接毒。將YAN98株F21代鵝胚成纖維細(xì)胞毒用DMEM做10倍倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個稀釋度接種培養(yǎng)，0.1 mL/孔，每稀釋度接四孔。37℃吸附培養(yǎng)1 h，棄吸附液，加含3%犢牛血清DMEM營養(yǎng)液，37℃靜止培養(yǎng)，120 h終判。按Reed-Muench兩氏法計算毒價。

1.5結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增F21代病毒液反復(fù)凍融3次后，按DNA抽提試劑盒說明書提取F21代細(xì)胞毒及F0代鵝胚尿囊液中的DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6序列分析測得序列用DNAStar剪輯、拼接，再利用DNAStar軟件包中的Megalign軟件的Clustal W Method對F21序列與F0序列進(jìn)行比對，分析核苷酸和氨基酸序列改變，根據(jù)核苷酸改變及推導(dǎo)的氨基酸位點(diǎn)改變分析YAN98株在GEF細(xì)胞中的適應(yīng)及變異情況。

2　結(jié)果

2.1病毒在細(xì)胞中的適應(yīng)及PCR檢測結(jié)果對細(xì)胞毒感染5 d的GEF進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)GEF細(xì)胞接種F21代細(xì)胞毒后72 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，皺縮，單層細(xì)胞出現(xiàn)空隙直至從瓶壁脫落：同時培養(yǎng)的正常GEF細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。以F1、F2、F3、F4、F5代細(xì)胞毒及空白對照提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶為1 663 bp。結(jié)果見圖1。

圖1　PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2TCID50檢測結(jié)果將YAN98株鵝胚成纖維細(xì)胞毒按照連續(xù)10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種6個細(xì)胞孔，觀察并統(tǒng)計細(xì)胞病變孔數(shù)，按照Reed-Muench法計算TCID50，得到F21代細(xì)胞毒的病毒效價為105.5TCID50。

2.3核苷酸序列分析結(jié)果以F21代病毒細(xì)胞裂解液提取的DNA為模板，用2對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到2個片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符。將測得的2個片段進(jìn)行序列剪輯、拼接。本試驗(yàn)選用的病毒株結(jié)構(gòu)蛋白分別為VP1、VP2、VP3，其中VP1包含所有VP2和VP3的核苷酸序列，它們含有相同的羧基端［2-3］。本試驗(yàn)對F21代病毒與親本病毒F0代進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明，F(xiàn)21代與F0代結(jié)構(gòu)基因存在11個核苷酸差異位點(diǎn)，編碼區(qū)不存在堿基的插入與缺失。

2.4氨基酸序列差異分析結(jié)果將GPV細(xì)胞毒F21代與親本病毒F0代推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，F(xiàn)21代與F0代存在5個氨基酸差異位點(diǎn)，見表3。

3　討論

GPV在GEF細(xì)胞中的病毒效價在F21代達(dá)到105.5TCID50，并且將GEF細(xì)胞接種F12代細(xì)胞毒72 h后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，這些表明GPV已經(jīng)適應(yīng)GEF細(xì)胞。本試驗(yàn)采用分段PCR的方法擴(kuò)增得到結(jié)構(gòu)基因，包含1個開放閱讀框，編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括VP1、VP2和VP3，大小分別為2 199 bp、1 764 bp和1 605 bp，分別編碼732，587，534個氨基酸。

表3　VP蛋白氨基酸突變位點(diǎn)比較

縱觀整個細(xì)小病毒科基因組研究發(fā)現(xiàn)，所有細(xì)小病毒科成員基因組結(jié)構(gòu)非常相似，都是由結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因兩部分組成，而且非結(jié)構(gòu)基因序列同源性非常高，非常保守，而結(jié)構(gòu)蛋白基因序列是變異相對較大的部分，因此推測細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列可能是決定病毒毒力及組織嗜性的關(guān)鍵部位［4］。

VP3蛋白是主要的衣殼蛋白，VP2也參與衣殼蛋白的形成。VP3是GPV的主要免疫保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體。VP1可協(xié)助病毒或其DNA通過核孔轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，可與宿主細(xì)胞的特殊受體結(jié)合，使病毒粒子進(jìn)行有效感染［1-2］。

研究將測得的F21代結(jié)構(gòu)基因序列與F0代進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，有11個核苷酸差異位點(diǎn)，其中6個位于VP1，5個位于VP3，這些核苷酸改變，也可能對病毒適應(yīng)細(xì)胞過程起到重要作用。根據(jù)測得的F21代結(jié)構(gòu)基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列與原代毒株F0代推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)生5個氨基酸位點(diǎn)改變，這種改變可能對病毒毒力有影響：另一方面，VP1、VP2和VP3基因編碼氨基酸的改變可能在病毒適應(yīng)細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的作用。

［1］邱娜，邵周伍林，白小飛，等.鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒株基因序列分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，10：25-28.

［2］Brown K E，Green S W，Young N S.Goose parvovirus-an autonomous member of the dependovirus genus［J］.Virology，1995，210（2）：283-291.

［3］Smith D H，War D P，Linden R M.Comparative characterization of rep proteins from the helper-dependent adeno-associated virus type 2 and the autonomous goose parvovirus［J］.J Viol，1999，73（4）：2930-2937.

［4］Zadori Z，Stefancsik R，Rauch T，et al.Analysis of the complete nucleotide sequences of goose and Muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adenoassociated virus 2［J］. Virology，1995，212（2）：562-573.

S852.65

A

0529-6005（2016）09-0040-02

2015-10-29

王志強(qiáng)（1977-），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)方向，E-mail：zhiqiang92@hotmail.com