秦曉冰，王　璦，單　虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

水貂綠膿桿菌（山東株）血清分型和ERIC-PCR分型的研究

秦曉冰，王璦，單虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

為了探明水貂出血性肺炎病原和流行特點(diǎn)，2011-2012年對(duì)山東省15個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行水貂出血性肺炎流行病學(xué)調(diào)查。從病貂中分離出19株綠膿桿菌，分別測(cè)定了分離株的血清型，同時(shí)應(yīng)用腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC-PCR）對(duì)菌株進(jìn)行DNA分型。結(jié)果19株分離株中血清型G型15株，血清型B型2株，血清型E型和I型各1株；ERIC-PCR譜型表現(xiàn)為7種基因型，其中15株G型株存在于譜型Ⅰ～Ⅶ中（Ⅵ除外），B型株屬于譜型Ⅱ，I型株屬于譜型Ⅳ，E型株屬于譜型Ⅵ。表明山東地區(qū)水貂出血性肺炎由綠膿桿菌引起，其分離株血清型以G型為主，基因型呈現(xiàn)多樣性。

水貂；綠膿桿菌；血清分型；ERIC-PCR

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是廣泛存在于自然界，水、土壤、空氣、正常動(dòng)物的腸道、呼吸道、皮膚中的一種條件性致病菌。PA屬于革蘭陰性桿菌，引起以出血性肺炎和敗血癥為主要特征的人獸共患?。?-3］。PA是引起水貂出血性肺炎的主要病原菌，該病發(fā)病急、死亡快，呈地方性暴發(fā)流行，發(fā)病貂場(chǎng)死亡率在10%～50%［4］。近年來(lái)貂養(yǎng)殖場(chǎng)頻繁出現(xiàn)貂出血性肺炎的報(bào)道，該病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)貂業(yè)的發(fā)展。但該病臨床治療的難度卻在不斷增加，這是由于對(duì)PA的防治長(zhǎng)期依賴(lài)抗生素的使用，造成PA病原天然或獲得性多重耐藥，具有了廣譜耐藥性。

山東省是毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖大省，養(yǎng)貂數(shù)量占全國(guó)的2/3。本試驗(yàn)自2011年1月到2012年12月，從該省3個(gè)地區(qū)15個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的貂出血性肺炎病料中分離病原菌，經(jīng)生化鑒定獲得了19株綠膿桿菌，分別對(duì)各菌株進(jìn)行了血清型分型和ERIC-PCR分型。本試驗(yàn)旨在為水貂綠膿桿菌病的防治提供理論基礎(chǔ)，并且為水貂PA疫苗的研制提供了可行性思路及有效數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

試驗(yàn)菌株：2011-2012年，實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的19株水貂源綠膿桿菌。

1.2主要試劑綠膿桿菌血清分型用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自日本生研株式會(huì)社。dNTP、ExTaq DNA聚合酶、DL-2 000 DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。西班牙Biowest瓊脂糖，購(gòu)自上海夏夷實(shí)業(yè)有限公司；GoldView（GV），購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.3綠膿桿菌臨床分離株的血清學(xué)分型按陽(yáng)性血清試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

抗原的制備：將被檢菌株劃線接種于NAC培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24 h，再挑取單個(gè)菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。取單個(gè)菌落溶于100 μL生理鹽水，置于EP管中，制成抗原備用；（2）玻板凝集反應(yīng)：取10 μL抗原與20 μL血清在潔凈的玻板上充分混合，同時(shí)取10 μL抗原與20 μL生理鹽水混合作為空白對(duì)照；（3）結(jié)果判定：1 min內(nèi)，在透明的背景下觀察到有凝集塊，且空白對(duì)照為陰性，判定凝集反應(yīng)陽(yáng)性。

1.4綠膿桿菌ERIC-PCR分型技術(shù)的建立

1.4.1細(xì)菌總DNA提取參照《預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》［5］，細(xì)菌接種于培養(yǎng)基中，37℃搖床（300 r/ min）培養(yǎng)過(guò)夜，離心棄上清液，收集沉淀，加入6 μL 50 mg/mL的溶菌酶作用2 h，再加入NaCl、10% SDS、蛋白酶作用3 h，制成透明黏稠液體。取菌液加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，離心抽提，再離心沉淀洗滌，晾干后溶于50 μL dd H2O中，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)其吸光度值，計(jì)算DNA濃度。取4 μL電泳，作PCR模板用。

1.4.2ERIC-PCR反應(yīng)引物參照Debast等［6］報(bào)道，ERIC-2（5′-AAG TAA GTG ACT GGG TGA GCG-3′），反應(yīng)總體積25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，d-DNT 2 μL，引物1 μL，Tag酶2.5 U，DNA模板5 μL，含量分別為1、50、250 ng。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，然后 94℃ 45 s，38℃～46℃45 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.4.3PCR產(chǎn)物電泳和鑒定參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［7］方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。用0.5×TAE緩沖液配制25 mL 1%瓊脂糖凝膠，瓊脂糖在微波爐中加熱熔化后，加入2 μL GoldView（GV），混勻制凝膠板。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer混勻，加入上樣孔，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量DL-2 000作為對(duì)照，120 V恒壓電泳3 min，利用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增片段并拍照記錄。

1.4.4采用1.4.2中優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離到的19株水貂源綠膿桿菌進(jìn)行ERICPCR分析。

1.4.5DNA同一基因型判定標(biāo)準(zhǔn)以每一分離物的所有可見(jiàn)帶具有相同的移動(dòng)距離定為一型，帶移動(dòng)的距離不同或所有可見(jiàn)帶的移動(dòng)距離相同但缺少兩條帶以上定為另一基因型［8］。

2　結(jié)果

2.1綠膿桿菌血清學(xué)分型結(jié)果血清學(xué)分型凝集反應(yīng)明顯，分辨率為100%，結(jié)果見(jiàn)表1。在分離的19株綠膿桿菌中G型有15株，占分離株的78.9%，可見(jiàn)G型株在流行菌中占主導(dǎo)地位，將來(lái)可能作為疫苗源的備選菌株。其中還有2株B型株，E和I型株各1株。

表1　綠膿桿菌血清學(xué)分型結(jié)果

2.2綠膿桿菌ERIC-PCR分型結(jié)果

2.2.1ERIC-PCR最佳反應(yīng)條件的確定通過(guò)反復(fù)多次對(duì)ERIC-PCR反應(yīng)過(guò)程中的模板濃度、退火溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定了ERICPCR最佳反應(yīng)體系（見(jiàn)表2）。最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，42℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，7℃終延伸5 min。

表2　綠膿桿菌ERIC-PCR反應(yīng)體系 （25 μL）

2.2.2臨床分離株分型結(jié)果如圖1、2所示，對(duì)19株綠膿桿菌進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的特征性圖譜。其中，第1（2011、G）、6（2011、G）、10（2011、G）、11（2012、G）、12（2012、G）泳道為譜型Ⅰ；第2（2011、G）、4（2011、B）、5（2011、B）、7（2011、G）、8（2011、G）、9（2011、G）泳道為譜型Ⅱ；第3（2011、G）泳道為譜型Ⅲ；第13（2012、G）、14（2012、I）、15（2012、G）為譜型Ⅳ；第16（2012、G）、17（2012、G）泳道為譜型Ⅴ，18（2012、E）泳道為譜型Ⅵ、19（2012、G）泳道Ⅶ。由此可知這19株綠膿桿菌從分子生物學(xué)方法可分為7種血清型，并且同為G型的15株菌按照分子生物學(xué)方法分型存在于譜型Ⅰ～Ⅶ中（除譜型Ⅵ中沒(méi)有），B型屬于譜型Ⅱ，I型屬于譜型Ⅳ，E型屬于譜型Ⅵ。

表3　綠膿桿菌ERIC-PCR分型結(jié)果

圖1　綠膿桿菌ERIC-PCR分型結(jié)果

圖2　綠膿桿菌ERIC-PCR分型結(jié)果

3　討論

3.1血清學(xué)分型血清分型是研究細(xì)菌的基本方法之一，既可用于種和型的鑒別的同時(shí)，也是流行病學(xué)調(diào)查的重要手段。綠膿桿菌血清型眾多，目前國(guó)際上尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的分型方法。國(guó)際抗原分型系統(tǒng)（IATS）和日本生研株式會(huì)社血清分型系統(tǒng)是目前國(guó)際上通行的PA基本分型方法。前者根據(jù)細(xì)菌外膜蛋白抗原、脂多糖抗原的不同從而將細(xì)菌分成20個(gè)不同的血清型。后者有3群多價(jià)血清，共有A、B、C、D、E、F、G、H、I、G、K、L、M、N 14種血清型。通過(guò)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行血清學(xué)分型可對(duì)不同地區(qū)所檢出的不同菌株進(jìn)行比較，從而了解不同地區(qū)綠膿桿菌感染的規(guī)律。

丹麥［9］1998-2001年分離的72株水貂綠膿桿菌中G型占75%，B型占8%、C型占17%，說(shuō)明水貂綠膿桿菌感染以G型為主，歐洲和美國(guó)主要流行血清型也是G型。徐修禮等［10］采用日本血清分型系統(tǒng)對(duì)100株人源分離株進(jìn)行分型，分型結(jié)果以B型為主，其次為G型和E型，說(shuō)明人綠膿桿菌的感染以B型為主。本試驗(yàn)中，從山東省分離的水貂綠膿桿菌的分型結(jié)果來(lái)看，貂源感染以G型為主，這點(diǎn)與國(guó)內(nèi)其他貂源綠膿桿菌分型的結(jié)果是相一致的［11-13］，其次是B型，E型、I型也有分離到，這說(shuō)明山東地區(qū)水貂綠膿桿菌流行菌株既具有流行普遍性，又具有其地區(qū)特異性和復(fù)雜性。水貂綠膿桿菌血清型的鑒定為山東地區(qū)水貂綠膿桿菌疾病的防治提供了理論依據(jù)。

3.2分子生物學(xué)分型ERIC-PCR分型方法是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性指紋圖譜（RAPD）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種PCR方法。ERIC-PCR的原理是：許多革蘭陰性桿菌中存在一段約126 bp重復(fù)序列，即ERIC片段。這段序列散在分布于基因組中，遺傳性穩(wěn)定，在不同種間僅有拷貝數(shù)和位置的變化。這段序列具有高度保守性，依據(jù)此重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同一條泳道可得到多條50～3 000 bp的獨(dú)特條帶，形成指紋圖譜［14］。根據(jù)指紋圖譜的不同可區(qū)分細(xì)菌的株型。

國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者將ERIC-PCR與脈沖場(chǎng)凝膠電泳，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性等技術(shù)進(jìn)行了比較研究，證明ERIC-PCR退火溫度較高，錯(cuò)配較少，重復(fù)性?xún)?yōu)于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，與脈沖場(chǎng)凝膠電泳相比，重復(fù)性和其相當(dāng)，還可以克服脈沖場(chǎng)凝膠電泳所需儀器、試劑價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)通量小，耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)［15］。

晏群等采用ERIC-PCR分型技術(shù)對(duì)臨床分離的30株人源綠膿桿菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，30株綠膿桿菌中，來(lái)自于不同患者的27株綠膿桿菌指紋圖譜表現(xiàn)出多態(tài)性，同一患者不同時(shí)間分離的細(xì)菌具有相同的譜型［14］。宋振銀對(duì)屬于同一血清型的產(chǎn)氣莢膜梭菌做亞型分類(lèi)。按照菌株指紋圖譜相似率達(dá)到80%則判定為同一菌株的標(biāo)準(zhǔn)，ERIC-PCR將8株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分為5個(gè)亞型，REP-PCR分為3個(gè)亞型?？梢?jiàn)多重序列PCR反應(yīng)能夠?qū)Ξa(chǎn)氣莢膜梭菌的亞型做有效分類(lèi)，比較兩種重復(fù)序列反應(yīng)，ERIC-PCR對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌亞型分類(lèi)具有更好效果［16］。Hammer等［12］應(yīng)用脈沖場(chǎng)電泳方法對(duì)分離自55個(gè)水貂發(fā)病場(chǎng)的綠膿桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)，其中54個(gè)場(chǎng)分離的綠膿桿菌為同一亞型，并推測(cè)是同一株菌的傳播引起54個(gè)場(chǎng)的水貂感染綠膿桿菌型肺炎。

本研究采用ERIC-PCR分型方法對(duì)臨床上分離到的19株綠膿桿菌進(jìn)行分型，共可分為7個(gè)基因亞型?？芍綎|地區(qū)綠膿桿菌基因型呈現(xiàn)多樣性。

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Comparison of Pseudomonas aeruginosa isolates from mink in Shandong provinceby serotyping and enterobacterial repetitiveintergenic consensus PCR

QIN Xiao-bing，WANG Ai，SHAN Hu
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao agricultural University，Qingdao 266109，China）

Minks suffering from hemorrhagic pneumonia occur frequently in large-scale mink farms in Shandong province over the past several years.The objective of the experiment was to study the etiological characteristics on the basis of the epidemiological investigations from 20 large-scale mink farms in Shandong province from 2011 to 2012.Nineteen strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from sick and/or dead minks were identified by the biochemical characterizations，serotype，and genotype by enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR（Eric-PCR）.The 19 isolates were divided into four serotypes：group G（15/19），group B（2/19），group E（1/19）and group I（1/19）.The 19 strains were classified to 7 genotypes by Eric-PCR，including group G existed in spectral typeⅠ～Ⅶ（exceptⅥ），group B existed in spectral typeⅡ，group I existed in spectral typeⅣand group E existed in spectral typeⅥ.The results showed that Pseudomonas aeruginosa was isolated from the mink hemorrhagic pneumonia in Shandong district and most serotype of clinical isolated strains were group G and their genotypes had high degree of clonal diversity.

mink；Pseudomonas aeruginosa；serotyping；ERIC-PCR

SHAN Hu

S858.92

A

0529-6005（2016）09-0091-04

2015-05-20

科技部科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2012FY111000）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（博士基金）BS2011SW010；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)（2014ZZCX07105）

秦曉冰（1971-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病的診斷和生物制品研發(fā)，E-mail：xiaobingqin@yeah.net

單虎，E-mail：shanhu67@163.com