楊銀　高志勇

摘 要 植物在發(fā)育過程中會(huì)面臨多種病原菌的侵染，在長期的進(jìn)化中，植物演化出了兩道免疫防線來抑制病原菌的破壞。第一道防線是病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-Triggered Immunity，PTI），第二道防線是效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-Triggered-Immunity，ETI）。在ETI過程中，植物抗病基因編碼的抗病蛋白具有保守的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS）以及富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine rich repeat ，LRR），它能夠直接或者間接的識(shí)別病原菌釋放的效應(yīng)因子，引起效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)，引起植物細(xì)胞的主動(dòng)死亡，即超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR），進(jìn)而抑制病原菌的侵染。通過基因組分析，擬南芥中大約有125個(gè)植物抗病基因，但是只有RPM1 與RPS2等少數(shù)抗病基因的功能得到報(bào)道，并且對于植物抗病信號途徑的研究也不是很清楚。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的遺傳學(xué)分析方法去研究植物抗病基因的功能存在局限性，造成這種局限性的主要原因是因?yàn)橹参锟共』虻墓δ苋哂嘁约皡⑴c植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過的上下游基因缺失致死。筆者綜述了近年來關(guān)于植物抗病機(jī)制的研究進(jìn)展，并介紹了該領(lǐng)域主要存在的問題。

關(guān)鍵詞 抗病機(jī)制 抗病蛋白 超敏反應(yīng)

中圖分類號：S432.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.064

Research Progress on the Mechanism of Plant Disease Resistance

YANG Yin， GAO Zhiyong

（Key Laboratory of Hybrid Rice， School of Life Science， Wuhan University， Wuhan， Hubei 430072）

Abstract Plants in the development process will be faced with a variety of pathogen infection， in the long term evolution， the plant evolution of the two line of defense to inhibit the destruction of pathogenic bacteria. The first line of defense is the immune response （Immunity PAMP-Triggered， PTI） triggered by pathogen associated molecular patterns， and the second line of defense is the immune response （Effector-Triggered-Immunity， ETI） triggered by effector factors. In the ETI， plant disease resistance genes encoding resistance proteins with conserved nucleotide binding site （nucleotide binding site， NBS） and leucine rich repeats （leucine rich repeat LRR）， it can directly or indirectly to the identification of pathogenic bacteria release effect factor and effector triggered immunity induced by plant cell active death， namely hypersensitive response （Hypersensitive response HR）， thereby inhibiting pathogenic bacteria infection. Through genomic analysis， there are about 125 plant disease resistance genes in Arabidopsis， but only RPM1 and rps2 and a few other resistance gene function get reported， and the study of plant disease resistance signaling pathways is not very clear. This is because of the traditional genetics analysis method to study plant disease resistance genes of functional limitations， causing the main reason for this limitation is killed because of plant disease resistance genes are functionally redundant and involved in plant disease resistance signal transduction through the upstream and downstream gene deletion. The research progress of plant disease resistance mechanism in recent years is reviewed， and the main problems in this field are also introduced.

Key words resistance mechanism； resistant protein； hypersensitivity

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)面臨各種逆境，包括干旱、高溫、低溫、重金屬、病毒、細(xì)菌等各種致病菌，在嚴(yán)重時(shí)，會(huì)導(dǎo)致植物的死亡，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。為了抵抗致病菌的毒害作用，植物體演化出了一套完善的免疫系統(tǒng)，來抵抗病源微生物的感染，增加了植物的存活率。

植物和動(dòng)物最大的區(qū)別在于植物的整個(gè)生活周期中，植物大多數(shù)都被固著在同一個(gè)自然環(huán)境，不能夠主動(dòng)避開害蟲、病原菌的侵害，只能夠被動(dòng)接受各種害蟲以及病原菌的侵染，但植物卻進(jìn)化出了兩道防線來抵抗病原菌以及害蟲的破壞。第一道防線是病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-Triggered Immunity，PTI），這個(gè)過程是由植物細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體PRR識(shí)別病原菌的病原體相關(guān)的分子模式PAMP介導(dǎo)的免疫過程；第二道防線是效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-Triggered-Immunity，ETI），這個(gè)過程是由植物抗病基因編碼的抗病蛋白識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)因子所介導(dǎo)的免疫過程。在ETI過程中，植物體發(fā)生能夠超敏反應(yīng)（Hypersensitive Response，HR），即植物細(xì)胞的主動(dòng)性死亡過程，能抑制病原菌的增殖。

目前，植物的天然免疫系統(tǒng)被分為四個(gè)階段，第一個(gè)階段是由PRR識(shí)別PAMP介導(dǎo)的PTI，能夠抑制病原菌的生長；第二個(gè)階段是部分病原菌釋放致病效應(yīng)因子，干擾PTI，引起效應(yīng)因子觸發(fā)的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)病原菌的增殖；第三個(gè)階段是植物抗病基因編碼的抗病蛋白直接或間接地識(shí)別特異的效應(yīng)因子，引發(fā)ETI，往往會(huì)在病原菌的侵染位點(diǎn)引起超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）進(jìn)而再次抑制病原菌的生長；最后一個(gè)階段是部分效應(yīng)因子通過自然選擇的進(jìn)化機(jī)制，避免被植物抗病蛋白的識(shí)別，進(jìn)而抑制ETI，再次促進(jìn)植物病原菌的生長。①

1 病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)

第一道防線是當(dāng)病原菌接觸植物表層的時(shí)候，由保守的PAMP激發(fā)，它們被模式識(shí)別受體PRR所識(shí)別，因此，這一層次的免疫被叫做病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-Triggered Immunity，PTI）。大部分病原菌都具有保守的分子特征，即PAMP，包括真菌的幾丁質(zhì)、細(xì)菌的鞭毛蛋白、肽聚糖、脂多糖等，PRR識(shí)別并結(jié)合這些保守的PAMP后，會(huì)被激活，激活后的PRR結(jié)合BAK1，并相互磷酸化，形成有活性的復(fù)合體，最終磷酸化得PRR-BAK1復(fù)合體激活下游的MAPK或CDPK，引起PTI，抑制病原菌的增殖，起到免疫的作用（圖1）。②

2 效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)

當(dāng)病原菌侵染植物表面時(shí)，會(huì)被PRR識(shí)別，引起第一層防御應(yīng)答PTI，但部分病原菌能通過III型分泌系統(tǒng)向宿主植物細(xì)胞分泌多種效應(yīng)因子，③修飾植物抗病途徑的某個(gè)蛋白質(zhì)，抑制或者減弱植物的防御機(jī)制，從而促進(jìn)病原菌的增殖，最終引起植物發(fā)病。此時(shí)，植物抗病基因編碼的植物抗病蛋白能夠直接或者間接地去識(shí)別并結(jié)合效應(yīng)因子，引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在病原菌的侵染位點(diǎn)會(huì)發(fā)生HR，起到抑制病原菌侵染的作用。比如flg22是細(xì)菌的鞭毛蛋白成分，在侵染植物時(shí)，會(huì)被FLS2識(shí)別，進(jìn)而引起PTI免疫應(yīng)答，但實(shí)驗(yàn)表明病原菌至少產(chǎn)生了3種TTSS效應(yīng)因子（AvrPto，AvrPtoB和AvrPphB），通過抑制FLS2對flg22的識(shí)別，并促進(jìn)病原菌的增殖。

植物抗病蛋白直接識(shí)別效應(yīng)因子的顯著例子是水稻中抗病蛋白Pita，能夠直接結(jié)合稻瘟菌分泌的效應(yīng)因子AvrPita，抑制其功能，起到免疫的作用（圖2a）。大多數(shù)情況下，植物抗病蛋白都是通過間接方式，去識(shí)別效應(yīng)因子。最明顯的例子就是擬南芥中的植物抗病蛋白R(shí)PM1，病原菌分泌的效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrB將RIN4蛋白磷酸化，然后RPM1才能識(shí)別磷酸化的RIN4，最終引起HR，起到免疫的作用（圖2b）。

圖2 ETI：效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)

3 植物抗病蛋白

在高等植物免疫系統(tǒng)的長期演化中，進(jìn)化出了ETI天然免疫過程，而這種過程就是由植物抗病基因（Disease resistance gene，R gene）編碼的抗病蛋白介導(dǎo)的。當(dāng)抗病蛋白被相應(yīng)的效應(yīng)因子激活后，引起類似于動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡的超敏反應(yīng)，進(jìn)而抑制病原菌的生長；如果效應(yīng)因子沒能被抗病蛋白識(shí)別，就能抑制植物體的免疫應(yīng)答，致使植物發(fā)病。

玉米抗圓斑病基因（Hm1）是人們克隆的第一個(gè)植物抗病基因。截止到目前為止，人們主要是從擬南芥中克隆到大量的植物抗病基因，比如RPM1，RPS2等。大多數(shù)抗病基因編碼的植物抗病蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域，分別是核苷酸結(jié)合位點(diǎn)以及富含亮氨酸重復(fù)序列，有的抗病蛋白還含有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域等。④NBS結(jié)構(gòu)域是抗病蛋白的保守結(jié)構(gòu)，通常被稱為NB-ARC結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-Binding adaptor shared by Apaf-1， Resistance proteins and CED-4），可能參與結(jié)合并水解核苷酸，調(diào)控抗病蛋白的活性，并且Apaf-1和CED-4參與了哺乳動(dòng)物的細(xì)胞程序性死亡途徑，與抗病蛋白引起的超敏反應(yīng)非常相似，暗示了動(dòng)植物可能具有共同的祖先；⑤LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相對多樣，參與了與病原菌的協(xié)同進(jìn)化，能夠幫助抗病蛋白識(shí)別病原菌，研究證明LRR參與了病原菌的識(shí)別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此根據(jù)抗病蛋白的保守性結(jié)構(gòu)，將其分為四大類。

在擬南芥基因組中大約有125個(gè)植物抗病基因，這些抗病基因編碼的抗病蛋白能夠特異識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)因子，引起ETI。RPM1是一種功能得到報(bào)道的典型的抗病蛋白，具有NBS和LRR結(jié)構(gòu)域，能夠識(shí)別兩種Ⅲ型效應(yīng)因子，AvrRpm1和AvrB。⑥研究表明，AvrRpm1和AvrB被釋放到植物中是被定位在細(xì)胞膜上，使RIN4蛋白磷酸化，進(jìn)而激活RPM1蛋白的功能，也就是只有RIN4磷酸化后才能激活RPM1，但同時(shí)人們發(fā)現(xiàn)RPM1的突變體RPM1（D505V）也能模擬磷酸化的過程，即使不存在RIN4的時(shí)候也能發(fā)生自激活過程，引起超敏反應(yīng)。

4 超敏反應(yīng)

在病原菌侵染植物時(shí)，植物細(xì)胞會(huì)在病原菌侵染位點(diǎn)主動(dòng)的發(fā)生細(xì)胞死亡，形成枯斑，從而抑制病原菌生長，這種為了抑制病原菌而引起的主動(dòng)死亡的現(xiàn)象叫做超敏反應(yīng)（Hypersensitive Response，HR），這是一種主動(dòng)的有益的死亡現(xiàn)象，類似于動(dòng)物發(fā)育過程中的程序性細(xì)胞死亡，因此目前HR是指為了抑制病原菌生長而主動(dòng)引起的一種植物細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

HR發(fā)生后，在病原菌感染部位的植物葉片逐漸變?yōu)楹稚?，最終死亡，它對植物的抗病反應(yīng)有極其重要的作用，因?yàn)椴≡腥静课豢焖俚闹参锛?xì)胞死亡可以有效的抑制病原菌獲取營養(yǎng)物質(zhì)，明顯的抑制病原菌的增殖。在這個(gè)過程中，雖然會(huì)導(dǎo)致植物體部分葉片的枯萎死亡，但是局部組織的死亡不僅能夠形成一條天然的防線，抑制病原菌的繼續(xù)生長，而且死亡的植物細(xì)胞能夠積累酚醛樹脂，同時(shí)釋放植物抗毒素，同樣也會(huì)抑制病原菌的增殖，從而抑制病原菌對植物體的侵染，從而最終起到抵抗病原菌的目的。除此之外，HR還可以誘發(fā)周圍的組織的特異性防御反應(yīng)，最終使得植物獲得系統(tǒng)抗性。

HR的發(fā)生過程涉及到兩個(gè)主要步驟：（1）侵染植物的病原菌和植物體通過Avr蛋白與R蛋白之間的直接或間接作用而被識(shí)別；（2）信號分子的傳導(dǎo)，最后引起植物體發(fā)生HR。當(dāng)病原菌被識(shí)別后，產(chǎn)生活性氧中間體，同時(shí)引起離子流快速穿過細(xì)胞質(zhì)膜。⑦有研究表明，H2O2能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡，而超氧游離基則是ROI觸發(fā)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵成分；而超氧化物能夠擴(kuò)散并被歧化生成H2O2或者是其他的有毒的ROI，進(jìn)而破壞細(xì)胞質(zhì)膜。

活性氧中間體的產(chǎn)生以及XR的發(fā)生激活了植物體的防御反應(yīng)，包括激活抗病蛋白以及HR導(dǎo)致的主動(dòng)的細(xì)胞死亡，同時(shí)，保護(hù)機(jī)制也會(huì)被誘導(dǎo)發(fā)生，控制細(xì)胞死亡的程（下轉(zhuǎn)第186頁）（上接第139頁）度。除此之外，NO、茉莉酸、乙烯等都是HR相關(guān)的信號分子，并且，線粒體、液泡和蛋白酶等也參與了HR反應(yīng)的信號傳導(dǎo)及其調(diào)控。

5 遺傳學(xué)方法分析植物抗病基因的局限性

通過基因組分析，在擬南芥中一共有125個(gè)編碼核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（Nucleotide binding site，NBS）和富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine Rich Repeat ，LRR）的基因，但是目前僅有RPM1以及RPS2等少數(shù)幾個(gè)植物抗病基因的功能以及相關(guān)的信號途徑得到了報(bào)道，但是對于抗病的具體分子機(jī)制不清楚，這意味著絕大多數(shù)的植物抗病基因的功能仍然需要進(jìn)一步的研究。

研究這些基因功能的常用方法是通過突變體篩選，但是在研究植物抗病信號途徑的時(shí)候，這種傳統(tǒng)方法研究植物抗病基因的功能存在很大的局限性。首先植物基因敲除的周期長，工作量大；其次，對于參與植物抗病信號途徑的其它基因的缺失具有致死作用，所以沒辦法拿到植物的突變體，更不用說去研究這個(gè)基因的功能；最后，植物抗病基因可能存在大量的功能冗余。

RPM1基因是典型的植物抗病基因，能夠識(shí)別被效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrB磷酸化的RIN4蛋白，引起HR，但是對于其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍然了解不多，對于參與RPM1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)到途徑的上下游蛋白了解很少。有人通過傳統(tǒng)的遺傳學(xué)分析方法，期望篩選無法識(shí)別效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrB并引起HR的rpm1突變體，進(jìn)而鑒定參與RPM1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)到途徑的上下游蛋白，最后一共篩選到110個(gè)突變體，但其中95個(gè)突變體株系都是RPM1基因本身的突變，⑧所以這種篩選突變體分析基因功能的方法對于其他的基因也行可行性較高，但是對與植物抗病基因及其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究，卻存在很大的局限性。

6 討論

植物的天然免疫系統(tǒng)由PTI和ETI構(gòu)成，這對植物的正常生長是必須的。PTI是有PRR蛋白介導(dǎo)，而ETI則是由植物抗病基因編碼的抗病蛋白介導(dǎo)，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致超敏反應(yīng)的發(fā)生，但是對于超敏反應(yīng)和植物抗病之間的關(guān)系，目前爭論較多，對于兩者的因果關(guān)系仍然存在爭論，而且超敏反應(yīng)是否是植物抗病所必須，這個(gè)有待進(jìn)一步去研究。

目前，擬南芥中有125個(gè)抗病基因，但大多數(shù)抗病基因的功能都未得到報(bào)道，且相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也了解較少，主要的原因是引物抗病基因的冗余及上下游基因的確實(shí)致死，所以現(xiàn)在人們嘗試用新的方法去解決這個(gè)問題。本實(shí)驗(yàn)室嘗試用大腸桿菌和酵母去分析植物抗病基因的功能，取得了一定的進(jìn)展，初步證明了這種方法的可行性。

雖然，目前對植物抗病領(lǐng)域的研究仍然存在很多問題，但是隨著基因組測序技術(shù)、基因敲除技術(shù)、電子顯微技術(shù)以及其他各種技術(shù)手段的成熟，在不遠(yuǎn)的將來，對植物抗病的分子機(jī)制的研究一定會(huì)取得重大進(jìn)展，這對提高農(nóng)作物產(chǎn)量，解決糧食危機(jī)，具有重大的意義。

*通訊作者：高志勇

注釋

① Jones JDG， Dangl JL： The plant immune system. Nature 2006， 444（7117）：323-329.

② Dodds PN， Rathjen JP： Plant immunity： towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature reviews Genetics ，2010.11（8）：539-548.

③ Grant SR， Fisher EJ， Chang JH， Mole BM， Dangl JL： Subterfuge and Manipulation： Type III Effector Proteins of Phytopathogenic Bacteria. Annual Review of Microbiology 2006.60：425-449.

④ Staskawicz BJ， Ausubel FM， Baker BJ， Ellis JG， Jones JD： Molecular genetics of plant disease resistance. Science 1995， 268（5211）：661-667.

⑤ Liu P， Danot O， Richet E： A dual role for the inducer in signalling by MalT， a signal transduction ATPase with numerous domains （STAND）. Molecular microbiology 2013.90（6）：1309-1323.

⑥ Dangl JL， Ritter C， .， Gibbon MJ， Mur LA， Wood JR， Goss S， .， Mansfield J， .， Taylor JD， Vivian A， . Functional homologs of the Arabidopsis RPM1 disease resistance gene in bean and pea. The Plant cell 1992.4（11）：1359-1369.

⑦ Baker CJ， Orlandi EW， Mock NM： Harpin， An Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco Caused by Erwinia amylovora， Elicits Active Oxygen Production in Suspension Cells. Plant Physiol 1993.102（4）：1341-1344.

⑧ Tornero P： Large-Scale Structure -Function Analysis of the Arabidopsis RPM1 Disease Resistance Protein. The Plant Cell Online 2002.14（2）：435-450.