孟曉東，邱建宏*，周占松，趙新鴻

(1.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050082；2.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

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·泌外專欄論著·

SphK1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及對(duì)其增殖和轉(zhuǎn)移的影響

孟曉東1，邱建宏1*，周占松2，趙新鴻1

(1.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050082；2.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

目的探討鞘氨醇激酶1(sphingosine kinases-1, SphK1)在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其對(duì)尿路上皮癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。方法逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測(cè)膀胱癌患者膀胱癌組織和鄰近的正常組織SphK1 mRNA的表達(dá)。以佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)為SphK1激活劑、二甲基鞘氨醇(N-dimethyl D-erythrosphingsine,DMS)為SphK1抑制劑、0.9%NaCl為空白試劑將膀胱癌BIU-87細(xì)胞株分別處理為激活組、抑制組和空白對(duì)照組。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。Matrigel三維培養(yǎng)法觀察各組細(xì)胞血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)形成能力。結(jié)果對(duì)比膀胱尿路上皮癌組織及鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)癌組織中SphK1 mRNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織；SphK1激活劑可促進(jìn)BIU-87細(xì)胞增殖，促進(jìn)Matrigel構(gòu)建的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中VM的形成。SphK1抑制劑則能抑制BIU-87細(xì)胞增殖，三維培養(yǎng)中不能形成管狀VM。結(jié)論SphK1在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)VM形成有關(guān)。

膀胱腫瘤；鞘氨醇激酶1；細(xì)胞增殖doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.007

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中易發(fā)的首位腫瘤[1],具有較高的發(fā)病率和病死率。其中尿路上皮癌是其最常見的病理類型[2]。目前治療措施主要有手術(shù)、適形放療和局部灌注或全身化療等,但是經(jīng)上述措施單獨(dú)或合并治療后還經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤再發(fā)甚至轉(zhuǎn)移,預(yù)后不良[3]。脂類組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)鞘脂參與細(xì)胞的信號(hào)調(diào)控進(jìn)程，進(jìn)而影響細(xì)胞周期并具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[4]。其中鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)通過調(diào)控鞘脂代謝的平衡，在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移等眾多生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)SphK1在多數(shù)細(xì)胞中普遍表達(dá),但其在多種腫瘤中表達(dá)異常,包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等[6]。本研究旨在探討SphK1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其功能，報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1患者情況及組織來源收集2005年7月—2011年1月在中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院泌尿外科住院行手術(shù)治療的膀胱癌患者的冰凍腫瘤病理組織及癌旁組織?；颊咔闆r：男性41例，女性11例，年齡33～82歲，平均(57.0±19.7)歲。術(shù)前未行任何形式(腔內(nèi)或開放)手術(shù)處理并且未行任何形式的放射性治療、化學(xué)藥物治療及中成藥物治療。術(shù)后病理診斷符合：尿路上皮癌1級(jí)(G1)；尿路上皮癌2級(jí)(G2)；尿路上皮癌3級(jí)(G3)。手術(shù)或活組織檢查切下腫瘤組織后，30 min內(nèi)無菌條件下將腫瘤組織用滅菌生理鹽水沖洗兩遍后切除3/4用于病理檢查，1/4用于凍存。選取的標(biāo)本包括同一患者的腫瘤組織及瘤旁組織(距離病變部位2 cm以外)，2～5 mm，共52對(duì)。

本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞來源購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞株名稱：人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株(BIU-87)。組織來源：膀胱。形態(tài)特征：上皮樣細(xì)胞。培養(yǎng)條件：完全培養(yǎng)基，90%RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含2 mmol/L谷氨酰胺)+10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，將其置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)條件下培養(yǎng)擴(kuò)增，0.25%胰酶消化，傳代。

1.3主要試劑90% RPMI-1640培養(yǎng)液、10%FBS、青鏈霉素雙抗溶液、磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。Sphk1激動(dòng)劑佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。SphK1抑制劑二甲基鞘氨醇(N-dimethylsphingisine,DMS)購(gòu)自上?；菡\(chéng)生物科技有限公司。Martrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD，Bioscience公司。無血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Hank′s液購(gòu)自德國(guó)Merck公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自廣州奕源科技公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen15596-026。cDNA合成試劑盒、Premix Ex TaqTM購(gòu)自日本TaKaRa公司。引物、探針委托太原科瑞斯克公司合成。

1.4逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)將新鮮凍存的膀胱腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織液氮研磨，Trizol法提取總RNA,紫外分光光度法測(cè)定所提RNA純度和濃度;變性瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定所提取RNA質(zhì)量,檢測(cè)28s、18s條帶的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板行PCR擴(kuò)增。引物合成及探針標(biāo)記委托太原科瑞斯克公司完成。SphK1：上游為5′-CTTGCAGCTCTTCCGGAGTC-3′；下游為5′-GCTCAGTGAGCATCAGCGTG-3′。SphK1 Probe為5′-(FAM)CCCTTTTGGCTGAGGCTGAAAT-CTCC(TAMRA)-3′。擴(kuò)增長(zhǎng)度77bp。內(nèi)參選GAPDH：上游為5′-GACTCATGACCACAGTCC-ATGC-3′；下游為5′-AGAGGCAGGGATGATG-TTCTG-3′。GAPDH Probe為5′-(FAM)CATCA-CTGCCACCCAGAAGACTGTG(TAMRA)-3′。擴(kuò)增長(zhǎng)度123bp。用2-△△Ct法評(píng)估SphK1 mRNA的水平。

1.5BIU-87細(xì)胞分組培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BIU-87細(xì)胞，吸凈舊培養(yǎng)液，消化液消化，加入完全培養(yǎng)基停止消化過程。移液器將細(xì)胞懸浮液移入離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為10 000個(gè)/100 μL,移液器將細(xì)胞懸浮液加入96孔板中，每5孔為1個(gè)重復(fù)，依次加入PMA(100 mmol/L),DMS(80 μmol/L)及等量0.9%NaCl[7]。37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6觀察BIU-87細(xì)胞增殖能力的方法將BIU-87細(xì)胞行胰酶消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10 000個(gè)/100 μL。用移液器將細(xì)胞懸液混勻后加入到96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，并設(shè)置完全培養(yǎng)基調(diào)零孔，每孔設(shè)置5個(gè)重復(fù)，分為PMA組、DMS組和空白對(duì)照組(0.9%NaCl)，加入相應(yīng)藥物并于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)4、6、12、24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，注意不要加入氣泡以免影響OD值。繼續(xù)培養(yǎng)3 h。在紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)各組450 nm吸光度值。

1.7觀察各組血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)形成能力的方法將Matrigel在-4 ℃下放置12 h融化為液態(tài)。Eppendoff移液器槍頭和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上預(yù)冷。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔內(nèi)加入300 μL Matrigel原液，搖動(dòng)以使之均勻分布于孔的各個(gè)位置，避免氣泡產(chǎn)生。37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育此板30 min使其凝固，完成膠的包被。0.25%胰酶消化各處理組細(xì)胞為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，移液槍在每孔內(nèi)接種1 mL濃度為5×105/mL的各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組BIU-87細(xì)胞懸液，分別置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后終止培養(yǎng)，觀察各組BIU-87細(xì)胞在膠中形成交叉的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說明BIU-87細(xì)胞形成血管的雛形，稱其為VM。照相記錄各組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度：倒置顯微鏡下(×200)視野內(nèi)隨機(jī)取上、下、左、右、中5個(gè)視野，照相記錄并計(jì)數(shù)類似管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，取每個(gè)視野的均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SSPS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較分別采用成對(duì)樣本的t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1膀胱癌組織及癌旁組織中SphK1 mRNA的含量通過qRT-PCR方法檢測(cè)52對(duì)冰凍膀胱癌組織及其鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)SphK1 mRNA含量不同，腫瘤組織的相對(duì)表達(dá)量(3.51±1.19)高于正常膀胱黏膜組織的相對(duì)表達(dá)量(1.07±0.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.379,P<0.01)。

2.2各BIU-87細(xì)胞株增殖能力的變化不同組細(xì)胞在不同作用時(shí)間后，在紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)450 nm吸光度值，各組BIU-87細(xì)胞通過不同處理，增殖能力表現(xiàn)不同，3組在培養(yǎng)6 h之內(nèi)趨于穩(wěn)定，都有隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)增殖逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)(P<0.01)；對(duì)照組從12～48 h呈現(xiàn)出緩慢增殖狀態(tài)(P<0.05)，而PMA組較對(duì)照組的增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，DMS組的細(xì)胞增殖能力受到了明顯抑制(P<0.05)。見表1，圖1。

表1各組不同時(shí)點(diǎn)吸光值的單因素方差分析

組別4h6h12h24h48hFPPMA0.14±0.09*#0.16±0.073.26±0.06*#6.10±1.14#7.62±1.89#35.4630.000DMS0.13±0.050.11±0.041.08±0.04*1.62±0.08#2.97±0.11*876.3040.000對(duì)照組0.11±0.020.13±0.042.14±0.074.95±0.056.23±2.2323.4450.000F3.3090.7041058.97037.2365.992P0.0000.0000.0000.0000.037

*P<0.01與對(duì)照組比較#P<0.05，與DMS組比較(SNK-q檢驗(yàn))

圖1不同處理組不同時(shí)間OD值變化

Figure 1The OD changes of different groups in different time

2.3各組VM形成能力比較按照上述方法將各組細(xì)胞加入膠12、16、24 h后，照相記錄各組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度。觀察24 h，對(duì)照組和DMS組均無明顯VM形成；PMA組培養(yǎng)12 h無明顯變化，16 h有些纖維狀物質(zhì)出現(xiàn)，到24 h已有明顯的血管狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖2)。

圖2Matrigel三維培養(yǎng)法觀察各組VM能力

Figure 2Matrigel three-dimensional culture method to observe vasculogenic mimicry ability

3　討　　論

現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，受許多因素影響。多項(xiàng)研究證實(shí)了在膀胱癌的病程中，諸如趨化因子受體CXCR4及其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1[8-9]、基質(zhì)金屬蛋白酶中MMP-2、MMP-9[10-11]、VEGF[12]、整合素(Integrin)[13]、E-黏附素、γ連接素(γ-catenins)[14]、膀胱癌腫相關(guān)抗原(bladder tumor associated antigen，BTA)、核基質(zhì)蛋白22(nuclear martrix protein 22，NMP22)等，在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)較正常膀胱黏膜組織出現(xiàn)異常[15],而且其表達(dá)與膀胱癌的惡性程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。其中有些甚至可以作為影響膀胱癌進(jìn)展預(yù)后情況的獨(dú)立因素。還有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如LOH[16]、KAI-1[17]及腫瘤抑制基因PTEN[18]等在膀胱癌組織中表達(dá)異常，且與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子及基因均有可能作為膀胱腫瘤診斷以及防治的新靶點(diǎn)，針對(duì)這些分子在腫瘤發(fā)展中的作用實(shí)施特意的調(diào)控措施將會(huì)影響腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。這些基礎(chǔ)研究對(duì)尋找診治膀胱癌的分子治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。

脂類代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用：脂類中鞘磷脂的生物學(xué)行為不僅包括細(xì)胞膜的代謝與調(diào)節(jié)，也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)擴(kuò)散。鞘磷脂的活性代謝產(chǎn)物中鞘氨醇1-磷酸(sphingosine1-phosphate,S1P)，神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)和鞘氨醇(sphingosine,Sph)均是重要的信號(hào)分子。S1P具有促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和生存，刺激新生血管生成，抑制細(xì)胞凋亡的功能，而Cer與Sph則起著相反的作用，它們的功能與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程及細(xì)胞周期變化有關(guān)。Cer/Sph：S1P維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，這個(gè)動(dòng)態(tài)的相對(duì)平衡決定了這個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)，決定了它能否繼續(xù)生存。當(dāng)平衡傾向于Cer/Sph時(shí),細(xì)胞就準(zhǔn)備進(jìn)入程序性死亡途徑；而當(dāng)S1P水平增加時(shí)細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生存并出現(xiàn)增殖。這就是所謂的“鞘脂類可調(diào)變阻器(sphingolipid-rheostat)”[4-5]。通過此機(jī)制的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的影響，該理論為癌癥治療研究提供了新的思路。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SphK1在腫瘤組織中較正常組織表達(dá)明顯升高,已經(jīng)證實(shí)在包括乳腺癌、黑色素癌、肺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胃癌、子宮癌、腎癌、直腸癌等腫瘤患者中,共241對(duì)癌組織與癌旁正常組織通過癌癥分析陣列(clontech)相比,癌組織中的SphK1 mRNA表達(dá)較癌旁正常組織高出約2倍[19]。在http://www.oncomine.org/，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/的網(wǎng)站上都可以查到經(jīng)N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，NMU)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌模型、經(jīng)他莫西芬治療后復(fù)發(fā)的乳腺癌患者的癌組織中、黑色素瘤皮膚癌、晚期的宮頸癌、浸潤(rùn)性膀胱癌、樹突狀膠質(zhì)瘤、頭頸部癌、白血病(包括B、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓系白血病)、成年男性生殖細(xì)胞瘤等腫瘤組織的芯片分析顯示SphK1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著增加。本研究結(jié)果顯示SphK1在膀胱尿路上皮癌中像其他腫瘤一樣同樣存在表達(dá)異常，膀胱癌組織SphK1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移是影響腫瘤疾病患者預(yù)后好壞的重要原因。增殖、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其進(jìn)程受許多因素影響，最核心的原因源自于腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力。如前所述在可調(diào)脂質(zhì)變阻器的動(dòng)態(tài)平衡中SphK1起到了關(guān)鍵酶的作用。細(xì)胞內(nèi)Cer、Sph水平上升可由調(diào)控SphK1的活性下降實(shí)現(xiàn),S1P水平下降,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入凋亡。SphK1表達(dá)的變化不僅改變脂類分子的平衡,還能影響細(xì)胞周期，周期內(nèi)不同階段轉(zhuǎn)化的速率、腫瘤組織中S期細(xì)胞數(shù)量可受其上調(diào)而增加和提高,而腫瘤細(xì)胞的倍增時(shí)間會(huì)減少,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，其底物外源性S1P也會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。外源性S1P分泌出胞，可作為第二信使與細(xì)胞膜上的S1P受體結(jié)合，S1P受體屬于GPCR蛋白家族,不同受體在不同時(shí)間的表達(dá)激活會(huì)起到不同的生物學(xué)功能，GPCR蛋白家族的激活引發(fā)一些列下游信號(hào)，如Ras/Raf/ERK、PI3K/AKT/mTOR、Rac/Rho等。這些信號(hào)通路與細(xì)胞遷移、侵襲、增殖及血管新生都密切相關(guān)[20]。腫瘤的生物學(xué)特征之一即表現(xiàn)為迅速、不受控制的生長(zhǎng)，為了保證其快速的增長(zhǎng)速度，腫瘤組織都伴有豐富的血液供應(yīng)。血供如果欠佳會(huì)導(dǎo)致缺氧，缺氧產(chǎn)生的刺激信號(hào)會(huì)促進(jìn)新的血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管新生過程是一系列互相關(guān)聯(lián)的事件構(gòu)成，諸如內(nèi)皮細(xì)胞游離，細(xì)胞外基質(zhì)崩解，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，雛形血管構(gòu)建、延伸，與瘤內(nèi)部相溝通，內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集，血管擬態(tài)和淋巴管擬態(tài)形成等。S1P可通過其受體來維持內(nèi)皮細(xì)胞聚集構(gòu)成完整的屏障，促進(jìn)其向血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)方向的轉(zhuǎn)變，從而完成新生血管的形成[21]。Schwalm等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞在缺氧條件下的SphK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均呈上調(diào)態(tài)勢(shì)，而通過siRNA抑制SphK，減少細(xì)胞內(nèi)的S1P生產(chǎn)和釋放，進(jìn)而能阻止低氧誘導(dǎo)因子HIF-2α的表達(dá)。Ader等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)人類腫瘤細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、腎癌、肺癌，抑制SphK1活性能抑制HIF-1α的積累和轉(zhuǎn)錄活性。這些研究都表明在處于缺氧狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞中，SphK1為新生血管的建立以改變腫瘤的缺氧狀態(tài)起到了重要作用。Kolmakova等[24]的研究直接表明，SphK1可能在新生血管生成的調(diào)節(jié)中起作用,抑制其表達(dá)能夠抑制新生血管的形成。此外,Limaye等[25]的研究表明，SphK1的高表達(dá)能夠通過PECAM-1依賴的PI-3K/AKt激活以及調(diào)節(jié)Bcl-2家族活性來增強(qiáng)在缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的存活，這說明在缺氧條件下高表達(dá)SphK1可能促進(jìn)新生血管形成。Mizugishi等[26]在雙敲除SphK1和SphK2基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和脈管系統(tǒng)都存在發(fā)育紊亂，失去正常結(jié)構(gòu)。對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的研究均提示SphK1/S1P參與了VEGF以及血管新生的調(diào)節(jié)。

目前關(guān)于SphK1其是否參與尿路上皮癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程，通過什么具體通路，是調(diào)控信號(hào)蛋白還是直接作用，都尚不清楚。本研究從該分子著手，在腫瘤細(xì)胞水平，選用我國(guó)自行培養(yǎng)的人類膀胱癌細(xì)胞系BIU-87細(xì)胞株，通過用SphK1激動(dòng)劑PMA、SphK1抑制劑DMS處理BIU-87細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組，研究干預(yù)措施直接作用此分子后，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移功能是否出現(xiàn)變化。通過采取 CCK-8 法檢測(cè)經(jīng)處理后的不同組BIU-87細(xì)胞之間增殖能力變化，結(jié)果顯示經(jīng)PMA處理后的BIU-87細(xì)胞(PMA組)較對(duì)照組增殖能力增強(qiáng)，特別是在培養(yǎng)12 h以后，細(xì)胞的增殖能力明顯升高，而經(jīng)DMS處理的BIU細(xì)胞(DMS組)增殖能力較對(duì)照組受到了明顯抑制。本研究采取Matrigel三維培養(yǎng)法觀察腫瘤細(xì)胞的VM形成能力，觀察24 h，對(duì)照組和DMS組均無明顯VM形成，PMA組培養(yǎng)12 h無明顯變化，16 h有些纖維狀物質(zhì)出現(xiàn)，到24 h已有明顯的血管狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，表明SphK1激活劑作用于BIU-87細(xì)胞后才出現(xiàn)了VM趨勢(shì)。而膀胱癌細(xì)胞具有激活SphK1的作用，本研究顯示SphK1在細(xì)胞水平即可檢測(cè)到，也說明癌細(xì)胞具備了血管生成能力，能促進(jìn)膀胱腫瘤的增殖、侵襲，為其進(jìn)一步轉(zhuǎn)移擴(kuò)散提供了基礎(chǔ)。

總之，SphK1在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制與SphK1提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VM形成等機(jī)制有關(guān)。本研究對(duì)以SphK1為靶點(diǎn)的分子腫瘤治療提供了一定理論依據(jù)。

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(本文編輯：許卓文)

Expression of SphK1 and its effect on the proliferation and metastasis of bladder transitional cell carcinoma

MENG Xiao-dong1, QIU Jian-hong1*, ZHOU Zhan-song2, ZHAO Xin-hong1

(1.Department of Urology, the Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082,China;2.Department of Urology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

ObjectiveTo investigate the sphingosine kinase 1(SphK1) expression in bladder urothelial carcinoma and effects on the proliferation and metastasis of urothelial cancer cells. MethodsThe expression of mRNA in bladder urothelial cancer tissue and adjacent normal tissue SphK1 was detected by qRT-PCR method. Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) was used as SphK1 activator. N-dimethyl D-erythrosphingsine (DMS)was used as SphK1 inhibitor. 0.9% NaCl reagent was used as blank control. Bladder cancer cell line BIU-87 was treated as active group, control group and blank control group. The cell proliferations in each group were measured by CCK-8 method. Matrigel method was used to observe the vascular cells vasculogenic mimicry(VM) forming ability in three-dimensional culture method. ResultsThe expression of SphK1 mRNA in bladder urothelial cancer tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue. SphK1 activator can promote the proliferation of BIU-87 cells and to promote the formation of VM in the three dimensional culture system constructed by Matrigel. SphK1 inhibitors can inhibit the proliferation of BIU-87 cells, and can not form a tubular VM in three dimensional culture. ConclusionSphK1 plays an important role in the occurrence and development of bladder cancer, and its mechanism may be related to promoting the proliferation of cancer cells and promoting the formation of VM.

bladder cancer ;sphingosine kinase 1; cell proliferation

2016-10-20；

2016-10-24

孟曉東(1977-)，男，河北石家莊人，中國(guó)人民解放軍

。E-mail:hpyyqiujh@163.com

R737.14

A

1007-3205(2016)10-1139-06

白求恩國(guó)際和平醫(yī)院主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,從事泌尿外科疾病診治研究。