韓陳陳，馬 旸，李亦凡，汪 揚(yáng)，魏 偉

不同固定液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和EP4熒光染色的影響

韓陳陳，馬 旸，李亦凡，汪 揚(yáng)，魏 偉

采用4種固定液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）進(jìn)行固定：①-20℃無水甲醇溶液；②新鮮配制4 g/L多聚甲醛溶液；③久置（≥1個(gè)月）4 g/L多聚甲醛溶液；④3.7%甲醛溶液。觀察細(xì)胞形態(tài)和前列腺素受體4（EP4）免疫熒光染色效果。結(jié)果表明3.7%甲醛溶液固定后進(jìn)行免疫熒光染色顯示大部分細(xì)胞維持梭形或不規(guī)則多邊形，EP4熒光染色效果較佳；所以3.7%甲醛溶液固定液固定細(xì)胞20 min，HUVECs形態(tài)典型，EP4的熒光染色效果最佳。

固定液；內(nèi)皮細(xì)胞；EP4受體免疫熒光

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與血管壁之間的屏障，參與炎癥反應(yīng)［1］，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中起著極為關(guān)鍵的作用，其分化遷移、增殖等作用增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）滑膜血管新生，導(dǎo)致滑膜炎持續(xù)存在和血管翳生成［2］。前列腺素受體4（prostaglandin receptor 4，EP4）屬于G蛋白偶聯(lián)受體［3］，EP4脫敏在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身性免疫性疾病的發(fā)展中起著重要的作用［4-5］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）作為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生成［6-7］。但PGE2是否是通過EP4受體起作用及EP4受體表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的關(guān)系仍不清楚。在EP4免疫熒光的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，固定液對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響至關(guān)重要。該研究通過選擇不同的固定液，以期找到既能保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)又不影響免疫熒光染色的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 山羊抗兔EP4抗體（英國(guó)Abcam公司）；兔源的熒光二抗（美國(guó)molecular probes公司）；胎牛血清（美國(guó)HyClone公司）；胰酶（南京Wisent公司）；DMEM（美國(guó)Gibco公司）；DAPI（上海Beyotime公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；無水甲醇溶液（天津星馬克科技發(fā)展有限公司）；多聚甲醛固體（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醛溶液（37%～40%）（西隴化工股份有限公司）；TritonX-100（中國(guó)BIOSHARP公司）；BSA（上海Sigma公司）；IX-70熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；2306-2型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)SHEL LAB公司）。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）培養(yǎng) HUVECs（由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供）以2×106個(gè)/ml密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 不同固定方法 待HUVECs達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至5×104個(gè)/ml，將細(xì)胞以500 μl/孔接種至48孔培養(yǎng)板中，待第2天細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液進(jìn)行固定。不同固定方法：①-20℃預(yù)冷的無水甲醇溶液，室溫5 min；②新鮮配制的4 g/L多聚甲醛溶液，室溫20 min；③久置4 g/ L多聚甲醛溶液，室溫20 min；④3.7%甲醛溶液，室溫20 min。0.2%TritonX-100滲透作用15 min。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞在2%牛血清白蛋白（BSA）封閉液中封閉1 h后加入EP4抗體（稀釋比例1∶100），于4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過夜。用PBS洗滌液洗滌3次后，再加入稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗溶液，4℃?zhèn)葦[搖床上繼續(xù)孵育1 h（避光）。PBS洗滌液洗滌3次后，加DAPI染色，5 min，PBS洗滌液洗滌1次；盡快在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

圖1 不同固定液對(duì)HUVECs形態(tài)的影響 SP×100

2 結(jié)果

2.1 不同固定液對(duì)HUVECs形態(tài)的影響 4種細(xì)胞固定方法中，從HUVECs形態(tài)上看，以-20℃預(yù)冷的甲醇和新鮮配制4%多聚甲醛對(duì)HUVECs形態(tài)影響較小。見圖1。鏡下觀察正常培養(yǎng)的HUVECs形態(tài)良好，多呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則多邊形；-20℃無水甲醇溶液固定細(xì)胞，鏡下觀察HUVECs形態(tài)良好多呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則多邊形；新鮮配置的4 g/L多聚甲醛固定液固定細(xì)胞，鏡下觀察HUVECs大部分呈梭形，部分細(xì)胞形態(tài)變圓；久置的4 g/L多聚甲醛溶液，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)大部分變圓、變??；3.7%甲醛溶液固定液，鏡下觀察大部分HUVECs維持梭形或不規(guī)則多邊形，只有少數(shù)細(xì)胞變小。

2.2 不同固定液對(duì)EP4免疫熒光染色效果的影響

從EP4免疫熒光染色結(jié)果看，3.7%甲醛溶液固定，熒光染色效果最好，EP4受體在胞質(zhì)和胞膜表達(dá)，胞核無表達(dá)。見圖2。-20℃甲醇固定，熒光顯色模糊，EP4在胞質(zhì)、胞膜、胞核均有表達(dá)；新鮮配置的4%多聚甲醛溶液固定，熒光染色效果較好，EP4大部分在胞質(zhì)和胞膜表達(dá)，只有少數(shù)細(xì)胞胞核也有表達(dá)；久置的4%多聚甲醛溶液固定，DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察只有胞核而無胞膜和胞質(zhì)，未見EP4熒光染色，可能是實(shí)驗(yàn)過程中固定液破壞了細(xì)胞膜導(dǎo)致的；3.7%甲醛溶液固定，EP4在胞質(zhì)和胞膜表達(dá)，胞核無表達(dá)，熒光染色效果最好。

3 結(jié)論

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體），經(jīng)過反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下可分辨出抗原或抗體所在位置及性質(zhì)［8］。免疫熒光方法中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體，將抗原固定在原位，并保持其抗原性；同時(shí)使蛋白變性、凝固、沉淀，保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)［9］，所以選擇最佳固定液尤為重要。對(duì)能在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中正常使用的固定液要求有3點(diǎn)［10］：①保持細(xì)胞或組織原有的形態(tài)；②保護(hù)抗原原有的定位及抗原特性；③細(xì)胞或組織經(jīng)處理后具有良好的通透性，可使免疫化學(xué)試劑滲入。

圖2 不同固定液對(duì)EP4受體免疫熒光染色效果的影響 間接熒光染色×100

本研究結(jié)果表明，不同的固定液對(duì)HUVECs形態(tài)和EP4熒光染色有較大影響，3.7%甲醛溶液固定細(xì)胞20 min對(duì)保存HUVECs形態(tài)和抗原性效果最好。甲醛屬于交聯(lián)固定劑，可使細(xì)胞內(nèi)蛋白之間相互交聯(lián)保存抗原于原位，因此能較好地保存抗原及組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲醇固定是通過蛋白變性作用實(shí)現(xiàn)的，更真實(shí)地反映出骨架蛋白在細(xì)胞的分布。甲醇固定劑是脂溶性的，會(huì)損傷細(xì)胞的通透性，用甲醇固定后，熒光染色很弱且核區(qū)不明顯，染色彌散，這可能與甲醇類固定劑對(duì)細(xì)胞核固定不良且會(huì)使蛋白降解有關(guān)。多聚甲醛是交聯(lián)固定劑，能夠使細(xì)胞內(nèi)蛋白之間相互交聯(lián)保存抗原于原位，既能較好地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)得以固定。但其缺點(diǎn)在于其交聯(lián)作用可能阻礙抗體的滲透，造成染色模糊［11］。同時(shí)，固定液放置一定時(shí)間可發(fā)生重聚作用，而且重聚作用的速度取決于pH值，pH值低時(shí)聚合加快，使固定效果下降［12］。因此，本研究根據(jù)抗原對(duì)固定劑的穩(wěn)定性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的要求，在保持抗原性及細(xì)胞形態(tài)之間做某些選擇，使最大限度地減少固定劑對(duì)抗原性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用。

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Effect of different fixative on endothelial cells morphology and immunostaining of EP4 receptor

Han Chenchen，Ma Yang，Li Yifan，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，
Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education，
Anhui Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

Human umbilical endothelial cells（HUVECs）were fixed by four different fixative，①cells were fixed with precooled methanolsolution（-20℃）；②cells were fixed with fresh preparation of 4 g/L paraformaldehyde solution（PFA）；③cells were fixed with old 4 g/L PFA solution（more than a month）；④ cells were fixed with 3.7%formaldehydesolution.Cells which were fixed with 3.7%formaldehydesolution maintained fusiform or irregular polygon，and the prostaglandin recepter 4（EP4）immunostaining effect was the best.We concluded that 3.7% formaldehydesolution for 20 min was suitable for HUVECs immunofluorescence，HUVECs maintain typical cell morphology and the EP4 immunostaining effect was the best.

fixative；HUVECs cell morphology；EP4 immunofluoresce

R 9-331；R 361.2

A

1000-1492（2016）09-1372-03

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.064.html

2016-04-14接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81502123、81330081）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085QH130）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2014A119）

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230032

韓陳陳，女，碩士研究生； 魏 偉，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei@ahmu.edu.cn； 馬 旸，女，博士，講師，責(zé)任作者，E-mail：mayang_ahmu@ 126.com