侯明，趙軍平，李明沅，甘煥輝

（桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林　541004）

釩脅迫下枸杞和芥菜幼苗蛋白的分子分布研究

侯明，趙軍平，李明沅，甘煥輝

（桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004）

通過G-75凝膠層析結(jié)合電泳分析，研究了不同V（吁）濃度脅迫下枸杞和芥菜的蛋白分子分布。經(jīng)過凝膠層析后出現(xiàn)兩個紫外吸收峰，第一峰主要集中在8號至15號管，第二峰集中在25號至33號管。對第一紫外吸收峰的電泳分析表明，V脅迫下植物蛋白的分子分布發(fā)生了變化：當V濃度為10 mg·L-1時，枸杞根產(chǎn)生了分子量為58.6 KD蛋白，莖產(chǎn)生了分子量分別為64.5、46.9 KD兩種蛋白；當V濃度增大到20 mg·L-1，葉產(chǎn)生了分子量為20 KD蛋白。隨著V脅迫濃度增大，芥菜中分子量為33.9 KD和36 KD兩入蛋白入帶逐漸變淺，而27.3 KD蛋白入帶逐漸加深。枸杞幼苗第一洗脫峰蛋白中V含量隨V脅迫濃度增大而增加，而芥菜葉在V逸10 mg·L-1時V含量降低。這與不同植物蛋白結(jié)合V的能力有關(guān)，因枸杞幼苗蛋白結(jié)合V的能力較強，生成的植物螯合肽較多，故對V有較強的耐受能力。

釩脅迫；枸杞；芥菜；分子分布；蛋白質(zhì)

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重金屬污染是全球性環(huán)境問題，它不僅威脅生態(tài)安全，而且通過食物鏈的生物富集和傳遞危及人類健康［1-2］。隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，關(guān)于蔬菜作物重金屬富集的分子機制研究也有了一定的進展。大多數(shù)重金屬離子是通過原生質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白進入植物細胞［3-4］，分子分布是研究重金屬元素進入植物體后，在各種蛋白質(zhì)中的積累以及與蛋白質(zhì)發(fā)生的化學行為。從分子水平上解釋植物重金屬中毒與解毒機理，有助于理解重金屬污染下的植物吸收、累積、耐性和解毒機制［5-6］。Li和王芳［7-8］等研究了Cd處理對小麥和水稻蛋白的影響，Cd進入植物根和葉片中與不同分子量蛋白結(jié)合，降低Cd的毒害。張靜等［9］研究水稻根中PCs可螯合一定量的Cd，也可影響到Cd在水稻中的積累和運轉(zhuǎn)。Weigel等［10］進行凝膠層析顯示，細胞可溶部分中Cd大多與分子量為5～10 KD的蛋白物質(zhì)結(jié)合，屬于肽類或低分子量蛋白。江行玉等［11］研究Pb在蘆葦體內(nèi)蛋白中的分布發(fā)現(xiàn)，在Pb脅迫下，出現(xiàn)了一種Pb誘導的新蛋白質(zhì)，而另一種蛋白質(zhì)則由于受到Pb影響而消失。Estrella-G佼mez等［12］研究了Pb在香根草中的分子分布，結(jié)果表明香根草根部維管組織細胞能夠響應Pb脅迫表達植物螯合態(tài)（PCs）蛋白，并與Pb結(jié)合形成Pb-PC蛋白復合體。目前，對釩（V）脅迫下枸杞和芥菜的分子分布研究還未見報道。

V在自然界中分布極為廣泛，過量V不僅妨礙植物從土壤和營養(yǎng)液中吸收一些必需元素，引起植物營養(yǎng)缺乏和枯萎，植物中積累過量V也會導致植物中毒甚至死亡［13-16］。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者和主要體現(xiàn)者，從蛋白組學分子水平開展植物對V脅迫的響應研究，能揭示V對植物生命活動的影響，也可以為了解植物的生理病理現(xiàn)象提供重要方法［17］。本研究探討了V（吁）脅迫下枸杞和芥菜幼苗不同器官蛋白的分子分布，掌握了不同植物內(nèi)部蛋白的分子分布規(guī)律，試圖揭示V在植物分子水平上的結(jié)合位置，為闡明植物對V的解毒機制提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試枸杞（Lycium barbarum）種子為寧杞一號種。盆栽試驗使用河沙，經(jīng)酸處理后洗至中性，風干后過0.8 mm篩，備用。供試芥菜（Brassica juncea）品種為大坪鋪包心芥菜。配制營養(yǎng)液的試劑和所選用的V（NH4VO3）均為分析純，試驗所用水為超純水。

1.2試驗設計和來理

用10%H2O2（含少量CaSO4）消毒過的種子30益恒溫催芽，播種于裝有經(jīng)過處理的河沙塑料盆中培育。幼苗長至2片葉時，用Hoagland全營養(yǎng)液每天澆灌1～2次。

待芥菜幼苗長出4～6片葉時，每盆選取長勢一致的幼苗定株5株，用含V的營養(yǎng)液澆灌，試驗設計5個處理水平，V（吁）濃度為0、1、5、10、20 mg·L-1，每個處理設定6個重復，脅迫10 d后采集樣品。

待沙培枸杞幼苗長出3～5對葉時用一次性塑料水杯（規(guī)格150 mL）定株3株進行水培脅迫試驗，設置V（吁）濃度為0、5、10、20 mg·L-1，每個濃度梯度設置10個重復，每個杯子裝含有V（吁）的營養(yǎng)液100 mL，每3 d換一次營養(yǎng)液，脅迫12 d收樣。

將植物樣品分成葉片、葉柄和根系分別洗凈晾干。植株根系先用自來水沖洗，再用20 mmol·L-1Na2-EDTA交換20 min，以除去根表面吸附的V。所有鮮樣置于-20益冰箱供分析測定。

1.3試驗方法

1.3.1植物蛋白的凝膠層析分離

參照Guo等［18］方法，分別取枸杞根、莖、葉和芥菜葉各4 g，用8 mL預冷的勻漿液勻漿化。勻漿液組成為：Tris-HCl（pH 7.5）15 mmol·L-1，NaCl 0.1 mol·L-1。將植物組織勻漿放入冷凍離心機，控制轉(zhuǎn)速為12 000 g，離心45 min，濃縮、過濾后，用葡聚糖凝膠G-75細粒（Sephadex G-75，1×100 cm，分子量3～80 KD）進行凝膠過濾。上柱樣品1 mL，流速2.4 mL·10 min-1，平衡及洗脫液為20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5），自動部分收集器每管2.4 mL收集洗脫液，采用紫外分光光度計在280 nm處掃描測定各洗脫液的吸收峰，合并每個吸收譜線范圍內(nèi)的洗脫液，并冷凍濃縮干燥，以備電泳分析。

1.3.2蛋白分子量的測定

（1）SDS-PAGE電泳操作：取冷凍干燥濃縮后的研磨離心液和層析后的收集液與樣品緩沖液按1頤2混合均勻。樣品緩沖液組成：SDS 100 mg+巰基乙醇0.1 mL+溴酚藍2 mg+甘油2 g+0.05 mol·L-1pH 8 Tris-HCl 2 mL。恒溫水浴鍋中100益煮沸5 min，冷卻備用。配置12%和5%分離膠，加入樣品和標準液電泳，直到分離膠中藍色入帶距離下沿1 cm左右時切斷電源，染色、洗脫得到蛋白質(zhì)入帶電泳圖。

（2）標準曲線的制作：測量標準蛋白各入?yún)^(qū)帶中心距離加樣端的長度，利用下面公式計算各種標準蛋白質(zhì)的相對遷移率，再以相對遷移率為橫坐標，各標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標制做標準曲線圖。

相對遷移率=蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離/溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端的距離

（3）樣液中主要蛋白質(zhì)分子量的計算：測量各個蛋白質(zhì)樣液中各入主要蛋白質(zhì)區(qū)帶中心距離加樣端的長度，計算出相對遷移率，根據(jù)標準曲線方程得出各蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)，進而可得知各蛋白質(zhì)的分子量。

1.3.3蛋白溶液中V含量的測定

按樣品與勻漿液的比例1頤2（g·mL-1）用瑪瑙研缽冰浴研磨，將凝膠層析后的收集液置于電熱板上蒸至近干，加入H2O2-HNO3（1頤5，V/V）消煮至澄清，加入1 mL 2.5%的EDTA搖勻，水定容10 mL，用石墨爐原子吸收分光光度法（GFAAS，novAA400P，Analytik Jena AG）測定V含量。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行分析，Duncan多重比較法對顯著性差異（P＜0.05）進行多重比較，試驗結(jié)果以平均值依標準差（Mean依SD）表示。

2　結(jié)果與分析

2.1V（吁）脅迫植物蛋白凝膠層析結(jié)果

圖1顯示植物樣品凝膠層析洗脫液中蛋白質(zhì)紫外吸收結(jié)果。由圖可見，洗脫液出現(xiàn)2個明顯紫外吸收峰，不同濃度V（吁）脅迫下枸杞不同部位和芥菜葉洗脫液的出峰位置大致相同，但是吸收峰值不同。V（吁）脅迫濃度不同，各峰表現(xiàn)出不規(guī)則變化，第一峰尖銳，第二峰變化平緩。通過對第一吸收峰分析發(fā)現(xiàn)，枸杞根和莖的吸收峰值均隨著V（吁）脅迫濃度的增大表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，根在V（吁）脅迫濃度為10 mg·L-1時峰值達到最大，而莖在其濃度為5 mg·L-1時峰值最大，葉的吸收峰值則一直呈增大趨勢。蛋白質(zhì)主要集中在第一吸收峰，在V（吁）處理下植物蛋白的種類或含量發(fā)生了變化。植物的不同吸收峰范圍內(nèi)洗脫液管數(shù)不同，枸杞根、莖和葉的第一峰均在8至15管，第二峰均在25至33管（圖1 A、圖1B、圖1C）；而芥菜葉的第一峰在12至17管，第二峰在27至35管（圖1D），兩個吸收峰之間都相隔10管，且無吸收峰重疊，說明兩個吸收峰分離較徹底。合并兩個峰對應管數(shù)的洗脫液進行多次電泳試驗發(fā)現(xiàn)，第一個峰電泳入帶明顯，而第二個峰并無入帶，可能是第二個峰的蛋白分子量太低（為一些小分子量的多肽），不能在電泳圖上顯示出來，因此主要通過對第一個峰內(nèi)包含的收集液進行電泳分析，研究V（吁）脅迫下植物不同器官蛋白的分子分布，同時測定峰面積內(nèi)V含量。

2.2植物不同部位蛋白的分子量分布

對枸杞根、莖、葉的電泳分析（圖2）表明，根和莖的蛋白種類較少，葉的蛋白種類較多。實驗發(fā)現(xiàn)未受V（吁）脅迫時枸杞根蛋白的表觀分子量為33.1 KD，受V（吁）脅迫誘發(fā)了一種分子量為30.1 KD新蛋白質(zhì)；當V（吁）脅迫濃度達10 mg·L-1時，又誘發(fā)產(chǎn)生了一種分子量為58.6 KD的蛋白，當V（吁）脅迫濃度達20mg·L-1時，58.6 KD蛋白消失（圖2a）。未受V（吁）脅迫時枸杞莖蛋白表觀分子量主要為42.1、37.9 KD，當V（吁）脅迫濃度為10 mg·L-1時，誘發(fā)產(chǎn)生兩種新蛋白，其分子量分別為64.5、46.9 KD（圖2b）。未受V（吁）脅迫的枸杞葉蛋白表觀分子量主要有84.8、49.8、46.8、33.3、23.7、18 KD，明顯多于根和莖（圖2c）。而受V影響枸杞葉分子量為84.8、49.8、46.8 KD的三種蛋白消失，當V（吁）濃度增大到20 mg·L-1時，誘導產(chǎn)生了一種分子量為20 KD的蛋白（圖2c）。以上數(shù)據(jù)表明，受V（吁）脅迫影響，枸杞根和莖產(chǎn)生了新的蛋白，而葉中一些原有的蛋白質(zhì)消失。圖2（d）表明，芥菜葉蛋白表觀分子量有53、48、14.2 KD三種，通過凝膠層析后，隨著V（吁）脅迫濃度增大，分子量為33.9、36 KD的兩入蛋白入帶逐漸變淺，而27.3 KD的蛋白質(zhì)入帶逐漸加深，表明植物在受到金屬脅迫時，會誘發(fā)體內(nèi)形成某種螯合肽或一些金屬結(jié)合蛋白，而蛋白質(zhì)入帶的深淺表明新誘導出來的蛋白質(zhì)的含量不同，與V（吁）的脅迫濃度有關(guān)。通過研究在V（吁）脅迫下枸杞和芥菜蛋白變化，表明金屬V（吁）脅迫下會誘導植物表達不一樣蛋白質(zhì)。

2.3凝膠層析后植物蛋白中V含量

表1為枸杞幼苗根、莖和葉經(jīng)過凝膠層析后第一洗脫峰中V的含量分布?？梢姡S著V脅迫濃度的增大，經(jīng)過凝膠分離后的蛋白中V含量逐漸上升，可能是由于植物的一種自適調(diào)節(jié)能力，通過產(chǎn)生一些新的金屬結(jié)合蛋白質(zhì)來降低金屬的毒害。以相同方法對芥菜葉凝膠層析后第一峰濃縮樣進行測定可知，芥菜的V含量不同于枸杞，在脅迫濃度為5 mg·L-1時，V含量最高為0.124滋g·g-1，當脅迫濃度增大到10 mg·L-1時，V含量（0.081滋g·g-1）開始下降?？赡苁怯捎诮娌说哪褪苣芰Σ蝗玷坭接酌?，當V濃度達到一定程度時，芥菜葉內(nèi)的V對蛋白表現(xiàn)出一定的毒性，蛋白與V結(jié)合能力下降，或者蛋白部分失活。

3　討論

蛋白質(zhì)不僅是生物有機體的重要組成部分，而且作為生物催化反應的酶類，在各種生理功能中發(fā)揮重要作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，V能在分子水平影響植物蛋白質(zhì)表達，不同植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子量分布不同，同種植物體內(nèi)不同部位的蛋白分布也不相同。凝膠層析結(jié)果表明，在未受V脅迫時，枸杞根、莖、葉蛋白分別對應1、2、5入亞基，葉的蛋白種類居多?？赡苁侵参锏恼４x需要一系列的光合和呼吸作用來維持，而葉是光合作用和呼吸作用的主要場所，其相關(guān)酶類越多，氨基酸種類就越豐富，含有的蛋白種類也越多。有毒金屬進入植物體內(nèi)時，能夠影響光合作用的酶，還能與蛋白質(zhì)上的SH結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的活性，干擾植物的正常新陳代謝［19］。

圖1　枸杞根、莖、葉和芥菜葉凝膠柱層析的紫外譜圖Figure 1　UV spectrum of gel chromatography of Lycium barbarum roots，stems and leaves and Brassica juncealeaves

蛋白質(zhì)組成變化的原因可能是蛋白質(zhì)降解為小分子量多肽，或者通過呼吸作用，寓同化于異化過程中而合成，也有可能是基因表達的產(chǎn)物。植物為了適應不同生長環(huán)境，體內(nèi)的各種代謝過程也不斷發(fā)生變化，這樣長期適應的結(jié)果，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生了一定變異，而遺傳物質(zhì)的變異主要通過蛋白質(zhì)上氨基酸變化呈現(xiàn)出來。研究認為，外源脅迫入件下植物可通過調(diào)節(jié)不同基因的表達來增強一系列脅迫蛋白的合成以適應各種不良環(huán)境，但同時會抑制其他許多正常蛋白質(zhì)的合成［20］。通過對V（吁）脅迫下枸杞和芥菜植物體內(nèi)蛋白變化的研究發(fā)現(xiàn)，枸杞根、莖、葉都會被誘導產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，根和葉分別產(chǎn)生了一種分子量為58.6、20 KD的蛋白，而莖產(chǎn)生了分子量為64.5、46.9 KD的兩種蛋白。V（吁）脅迫濃度過大時，會使植物葉中一些參與光合作用的蛋白質(zhì)發(fā)生降解和碎裂片段化，以及初級碳代謝蛋白下降，從而使某些蛋白質(zhì)消失。如當V（吁）脅迫時，枸杞葉分子量為84.8、49.8、46.8 KD的三種蛋白消失，而芥菜葉內(nèi)分子量為33.9、36 KD的兩入蛋白入帶逐漸變淺，27.3 KD的蛋白入帶逐漸加深，說明蛋白質(zhì)代謝的這種變化可能是植物的一種適應性反應，它有利于植物抵抗外界的傷害［21-23］。

圖2　枸杞幼苗的根、莖和葉及芥菜葉電泳圖Figure 2　Electrophoretogram of roots，stems and leaves from Lycium barbarum seedling and of Brassicajuncea leaves

表1　凝膠層析后枸杞幼苗在第一洗脫峰中V含量Table 1　Concentrations of V in the first peak elution of Lycium barbarum seedlings after gel chromatography

凝膠層析電泳結(jié)果表明，在不同V（吁）脅迫濃度下，植物不同部位在調(diào)節(jié)自身防御機制以降低逆境傷害時的蛋白變化是不一樣的。對于枸杞根存在分子量為33.1 KD和新產(chǎn)生的30.1、58.6 KD三種蛋白，枸杞莖存在分子量為37.9、42.1 KD和新產(chǎn)生的46.9、64.5 KD四種蛋白，葉則有18、23.7、33.3 KD和新產(chǎn)生的20 KD四種蛋白，結(jié)合植物相應的V含量分布結(jié)果，表明在枸杞不同部位V可能與這些分子量的蛋白結(jié)合。隨V（吁）脅迫濃度增大，第一個洗脫峰內(nèi)枸杞根、莖和葉中蛋白結(jié)合V量逐漸增大，說明枸杞不同部位中不同蛋白質(zhì)對V的結(jié)合能力不同，使其根部產(chǎn)生新的蛋白，葉和莖除產(chǎn)生新蛋白外還伴隨一些蛋白消失。這與Zhang等［21］對Cu脅迫下水稻幼苗中分子量為12 KD和20 KD的兩入蛋白入帶顏色逐漸加深的結(jié)果類似。植物根部有很大一部分空間用來吸收營養(yǎng)元素和可溶物質(zhì)，當重金屬進入植物根部后，會誘導植物細胞質(zhì)壁分離，細胞間隙擴大，進而結(jié)合部分重金屬離子［24-26］，還有一大部分金屬會以螯合態(tài)的可溶形式固定于植物根部［27］，產(chǎn)生較多金屬結(jié)合蛋白起到解毒作用。隨著V（吁）脅迫濃度升高，芥菜葉的第一洗脫峰內(nèi)V含量升高，當V（吁）逸10 mg·L-1時，V含量下降，表明芥菜葉與蛋白結(jié)合的V量有所降低，可見芥菜對V的耐受能力小于枸杞。

4　結(jié)論

（1）V（吁）脅迫濃度不同，枸杞和芥菜的凝膠層析紫外吸收峰位置相同但峰值不同。對第一峰進行蛋白分子分布研究表明，在V（吁）濃度增大到10 mg·L-1時，枸杞根產(chǎn)生了分子量為58.6 KD蛋白，莖產(chǎn)生了分子量為64.5、46.9 KD兩種蛋白；當V（吁）濃度增大到20 mg·L-1，葉產(chǎn)生了分子量為20 KD蛋白。

（2）隨著V（吁）脅迫濃度增大，芥菜中分子量為33.9 KD和36 KD兩入蛋白入帶逐漸變淺，而分子量為27.3 KD蛋白質(zhì)入帶逐漸加深，表明受V（吁）脅迫影響，植物的蛋白合成發(fā)生變化，蛋白分子分布發(fā)生改變。

（3）枸杞幼苗第一洗脫峰蛋白中，V含量隨V（吁）脅迫濃度增大而增加，其分布規(guī)律為根＞葉＞莖，而芥菜葉在V（吁）逸10 mg·L-1時表現(xiàn)為V含量降低。受V影響枸杞中蛋白與V結(jié)合生成的植物螯合肽較多，而芥菜葉蛋白結(jié)合V能力下降或蛋白失活，枸杞對V有一定的解毒作用。

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Distribution of protein molecular in seedlings of Lycium barbarum and Brassica juncea under vanadium stresses

HOU Ming，ZHAO Jun-ping，LI Ming-yuan，GAN Huan-hui
（College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

Protein molecular distribution in Lycium barbarum and Brassica juncea under different vanadium（V）stress levels was studied by G-75 gel chromatography and electrophoresis analysis.After gel chromatography，two UV peaks appeared，with the first peak occurring in No.8～No.15 tubes，and the second peak in No.25～No.33 tubes.Results of electrophoresis analysis from the first UV peak indicated that the molecular weight distribution changed under the V stresses.At 10 mg V·L-1，Lycium barbarum produced a kind of protein with molecular weight of 58.6 KD in roots，while in stems two kinds of protein with molecular weight of 64.5 and 46.9 KD.At 20 mg V·L-1，the leaves produced a kind of protein with molecular weight of 20 KD.With V stress levels increasing，two protein bands with 33.9 KD and 36 KD in Brassica juncea gradually changed to shallow，but that with 27.3 KD was deepened progressively.The V concentrations in the protein of the first elution peak in Lycium barbarum seedlings increased with increasing V stress levels，while the V concentrations in leaves of Brassica juncea decreased when V stress levels逸10 mg·L-1.This may be due to differences in V-binding capacity of different plant proteins.The V-binding ability of Lycium barbarum seedlings was greater than that of Brassica juncea，and thus more phytochelatins were generated，resulting in stronger tolerance of Lycium barbarum seedlings to V.

vanadium stress；Lycium barbarum；Brassica juncea；molecular distribution；protein

X503.23

A

1672-2043（2016）04-0634-06

10.11654/jaes.2016.04.004

2015-11-15

國家自然科學基金項目（41161076，41561077）

侯明（1957—），山東濟寧人，博士，教授，主要從事生態(tài)毒理和植物修復研究。E-mail：glhou@glut.edu.cn