林珊，陳達(dá)鑫，蔡巧燕，彭軍，林久茂

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

Folin-Ciocaheu比色法測(cè)定白花蛇舌草總酚的含量

林珊1，2，陳達(dá)鑫1，2，蔡巧燕1，2，彭軍1，2，林久茂1，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

目的測(cè)定白花蛇舌草中總酚的含量。方法用Folin-Ciocaheu比色法，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，測(cè)定白花蛇舌草中總酚的含量。結(jié)果沒(méi)食子酸在0.82～5.74μg／m L線性關(guān)系良好，白花蛇舌草總酚含量為111.27 mg／g。結(jié)論Folin-Ciocaheu比色法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、可行，可為白花蛇舌草的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

白花蛇舌草；總酚；含量測(cè)定；Folin-Ciocaheu比色法

白花蛇舌草Hedyotis Diffusa Willd為茜草科草本植物，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛、抗菌消炎、抗腫瘤的功效，臨床治療惡性腫瘤、胃腸炎、闌尾炎、泌尿系感染等［1］。抗腫瘤活性為白花蛇舌草最重要的藥理活性，中醫(yī)一直用于腹部腫瘤治療和癌癥放療、化療后的輔助治療，效果明顯。我們課題組在藥理研究中發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草的抗腫瘤作用確切［2-4］。白花蛇舌草主要化學(xué)成分有萜類、黃酮類、蒽醌類、香豆素類和酚酸類等化合物，總酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多羥基酚類化合物的總稱，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用［5］。為了開(kāi)發(fā)利用白花蛇舌草中酚類化合物，我們用Folin-Ciocaheu比色法測(cè)定白花蛇舌草中總酚的含量，為白花蛇舌草的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1藥材白花蛇舌草購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，產(chǎn)自河南，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為茜草科植物白花蛇舌草。

1.2試劑沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%）；福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；其它試劑為分析純。

1.3儀器UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵、RZ01C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-S恒溫水浴鍋（鄭州市長(zhǎng)城科技工貿(mào)有限公司）；SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AR2130電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Elix5純水制備系統(tǒng)（廈門市精藝興業(yè)科技有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品4.1 mg，置25 mL瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，配制成0.164 mg／mL對(duì)照品溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備稱取60℃恒溫干燥的白花蛇舌草細(xì)粉1.5 g，加10倍量的85%乙醇，回流提取2次，每次1 h，過(guò)濾，合并過(guò)濾液，定容至25 mL瓶中，備用。

2.3含量測(cè)定

2.3.1測(cè)定波長(zhǎng)選擇吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液、供試品提取液各0.2 mL，置于10 mL瓶中，加60%乙醇各0.4 mL，蒸餾水3 mL，10%福林酚試劑2.5 mL，7.5%碳酸鈉溶液2 mL，加蒸餾水至刻度定容，在暗處反應(yīng)30 min。以60%乙醇做空白對(duì)照，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)400～800 nm波長(zhǎng)處掃描，以確定最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果沒(méi)食子酸和白花蛇舌草總酚在742 nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，置于10 mL瓶中，按2.3.1項(xiàng)的方法進(jìn)行顯色，以60 %乙醇溶液為空白，在742 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

A＝113.36C+0.0114 r＝0.9993

結(jié)果表明沒(méi)食子酸在0.82～5.74μg／mL線性關(guān)系良好。

2.3.3總酚含量測(cè)定按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，取樣品液0.2 mL，置10 mL瓶中，按2.3.2項(xiàng)的方法測(cè)其吸光度，計(jì)算總酚含量，并按下式計(jì)算總酚得率：

總酚得率＝總酚的含量／藥材的質(zhì)量×100%

結(jié)果見(jiàn)表1。RSD為0.68%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可行。

表1　總酚含量測(cè)定

2.3.4精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液0.2 mL（濃度0.164 mg／mL），按2.3.2項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。RSD為0.72%，表明方法精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液0.2 mL，在0、20、40、60、80、100、120 min，按2.3.2項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表3。RSD為1.53%，表明供試品溶液中總酚含量穩(wěn)定。

表2　精密度實(shí)驗(yàn)

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn)按2.2項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按2.3.2項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4。 RSD為0.70%，表明方法重復(fù)性良好。

表4　重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7回收率試驗(yàn)精密稱取白花蛇舌草6份，每份0.5 g，分別加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.2 mL（濃度0.164 mg／mL），按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，按2.3.2項(xiàng)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。計(jì)算回收率：

回收率＝（測(cè)得量－藥材含有量）／加入量×100%。

加樣回收率平均值為95.76%，RSD為1.54%。

表5　回收率實(shí)驗(yàn)

3　討論

3.1植物多酚的測(cè)定方法有多種，我們?cè)疾炱蒸斒克{(lán)法、重氮比色法，均因方法顯色不穩(wěn)定，或方法步驟復(fù)雜而未采用。Folin-Ciocaheu比色法操作較簡(jiǎn)單［6］，結(jié)果穩(wěn)定可靠，有利于快速測(cè)定大批量樣品，實(shí)驗(yàn)證明Folin-Ciocaheu法符合要求。

3.2由于白花蛇舌草中酚類物質(zhì)水溶性較差，因此在選擇提取溶劑時(shí)，我們考察了50%、60%、80%乙醇作為提取溶劑，最終采用60%乙醇為溶劑，所得的溶液顯色后測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定。

總之，F(xiàn)olin-Ciocaheu法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定、可行，可為白花蛇舌草的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］紀(jì)寶玉，范崇慶，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（19）：235-240.

［2］林久茂，彭軍，魏麗慧，等.白花蛇舌草提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.福建中醫(yī)藥，2010，41（5）：49-51.

［3］林久茂，魏麗慧，李瓊瑜，等.白花蛇舌草通過(guò)調(diào)控Wnt／βcatenin通路抑制大腸癌細(xì)胞及大腸癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（5）：1805-1808.

［4］CAIQ，LIN J，WEI L，et al.Hedyotis diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway［J］.International Journal of Molecular Sciences，2012，13（5）：6117-6128.

［5］楊璐，努爾比耶，李宏.新疆紅棗果實(shí)不同部位總酚的含量測(cè)定［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（1）：152-156.

［6］張科衛(wèi)，馬彩霞，繆六舒.Folin-Ciocaileu比色法測(cè)定不同產(chǎn)地生姜中總酚［J］.中成藥，2012，34（12）：2450-2452.

R284.1

B

1000-338X（2016）05-0031-02

2016-07-16

教育部博士點(diǎn)基金資助課題（20133519110003），陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金資助課題（CKJ2015007、CKJ2014013）

林珊（1981—），女，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

林久茂（1976—），男，副研究員。E-mail:jiumaolin@hotmail.com