陳文星，單書凱，李哲，葉志彬，賴春芬，艾柳英，張燎原，孫淑靜，胡開輝

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

〈育種與馴化〉

真姬菇雜交新菌株515的抗逆性分析*

陳文星，單書凱，李哲，葉志彬，賴春芬，艾柳英，張燎原，孫淑靜**，胡開輝

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

通過測定不同營養(yǎng)限制條件下真姬菇（Hypsizygus marmoreus）兩個品種白玉菇、灰蟹菇及其單核菌株雜交選育的新菌株515的菌絲生長速度及觀察形態(tài)特征，明確雜交菌株515的抗逆性。結(jié)果表明，灰蟹菇對各種營養(yǎng)脅迫具有較好的抗逆性。新菌株515對低氮條件適應(yīng)性較差，高無機鹽抑制了其菌絲的生長；低氮加吐溫后，其菌絲生長速度明顯高于灰蟹菇，菌絲形態(tài)潔白濃密、邊緣整齊，提高了菌株515對氮源脅迫的抗性；但在低碳條件下其菌絲生長速度較快，與菌株灰蟹菇相比有顯著差異，與菌株白玉菇相比無顯著差異，說明菌株515對碳源脅迫抵抗力較強。針對真姬菇栽培原料以碳源為主，說明該菌株具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

真姬菇；雜交菌株；菌絲形態(tài)；菌絲生長速度；抗逆性分析

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名玉蕈、蟹味菇，屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）離褶菌族（Lyophyllum）玉蕈屬（Hypsizygus）［1］。真姬菇含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，是一種高蛋白、低脂肪、低熱量的保健食品，具有較高的藥用價值［2］。經(jīng)常食用具有提高人體免疫力，預(yù)防衰老，延長壽命的功效［3］。是我國工廠化推廣栽培的重要食用菌品種之一，主要在上海、山西、河北、河南、山東及福建等省市推廣栽培［4］。目前栽培的有純白色和淺灰色2個品種，白色的品種稱為“白玉菇”，灰色品種稱為“灰蟹菇”。白玉菇的菌絲生長旺盛，發(fā)菌較快，是市場需求的主要菌種，但是抗逆性較弱，成熟的老菌絲還會分泌黃色液滴，形成菌皮［5］。而灰蟹菇的菌絲生長旺盛，發(fā)菌較快，抗雜菌能力強，且老菌絲不分泌黃色液滴，不形成菌皮，能產(chǎn)生節(jié)孢子及厚垣孢子［6］。

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）在生產(chǎn)過程中存在許多問題，如生產(chǎn)周期較長（120 d～150 d）［7］，菌體生長速度較慢，原料利用率低，抑制雜菌能力較差，易染菌，而且易受栽培環(huán)境和栽培條件的影響，在生產(chǎn)中受到一定的限制。從而增加了生產(chǎn)成本，影響了生產(chǎn)企業(yè)的效益［8-9］，與其它工廠化食用菌生產(chǎn)品種相比具有一定的劣勢。因此，培育生產(chǎn)周期短、抗逆性強的真姬菇優(yōu)良新品種，將會極大地促進真姬菇的工業(yè)化生產(chǎn)，降低真姬菇栽培成本，同時提高品種的抗逆性，解決真姬菇工廠化栽培的關(guān)鍵技術(shù)問題，這對促進食用菌產(chǎn)業(yè)向著工廠化方向穩(wěn)步快速發(fā)展有著重要意義。

本研究利用抗逆性強的灰蟹菇和備受市場歡迎的白玉菇作為親本，通過原生質(zhì)體制備的單核菌株雜交選育的新菌株515為材料，通過測定在不同營養(yǎng)限制條件下菌絲生長速度、菌絲形態(tài)，與菌株灰蟹菇和白玉菇比較，了解新品種真姬菇515的抗逆性，為該菌株的推廣生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

白玉菇由福建省龍巖泰和強農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；灰蟹菇從福州山姆會員店購買分離獲得；真姬菇515為本實驗室選育菌株，以下簡稱515。

1.1.2供試培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基（1 000 mL）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白胨3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、瓊脂20 g，pH自然。

低氮培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖10 g、硝酸銨0.2 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸鈉緩沖液100 mL。

吐溫20培養(yǎng)基（1 000 mL）：在低氮培養(yǎng)基中加1.0 g吐溫20。

高氮低碳培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖0.5 g、硝酸銨5 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸鈉緩沖液100 mL。

高無機鹽培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖10 g、硝酸銨0.2 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、CaCl20.1 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸鈉緩沖液100 mL。

低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖0.5 g、硝酸銨0.2 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸鈉緩沖液100 mL。

完全培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖15.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母粉2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g和瓊脂20.0 g。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)

將2個菌株（白玉菇、灰蟹菇）和雜交菌株（515）分別接種到PDA加富培養(yǎng)基中，然后置于24℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d～15 d。

1.2.2菌株生長速度測定

將活化好的白玉菇、灰蟹菇、真姬菇新品種515分別接種于低氮培養(yǎng)基、吐溫20培養(yǎng)基、高氮低碳培養(yǎng)基、高無機鹽培養(yǎng)基、低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基的平板接種菌塊（直徑1.5 cm）做3個重復(fù)，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第3天開始每隔2 d測其菌絲生長速度，并觀察其形態(tài)特征。

2　結(jié)果

2.1低氮培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

菌株515在低氮條件下，第11天灰蟹菇生長速度最快，直徑為7.62 cm；白玉菇次之；菌株515的生長速度最慢，直徑為5.07 cm，與2個菌株有顯著差異（P＜0.05），見圖1。

由圖1可見，菌株515在相同的低氮培養(yǎng)基中，與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)特征差異較大。白玉菇和灰蟹菇菌絲非常濃密、潔白，邊緣十分整齊，氣生菌絲較強；而真姬菇515菌株的菌絲濃密度較低，菌絲較弱，邊緣不整齊，氣生菌絲也十分虛弱，說明該新菌株對氮源脅迫適應(yīng)性較差。

2.2吐溫20培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

在加有吐溫20的低氮培養(yǎng)基中，第11天白玉菇生長速度最快，直徑為5.61 cm；菌株515次之；而灰蟹菇的生長速度最慢。菌株515與兩菌株相比有顯著差異（P＜0.05），見圖2。

圖1　低氮培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.1Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on low nitrogen medium（left）and morphological characteristics（right）

由圖2可見，菌株515在相同的吐溫20培養(yǎng)基上與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)特征無明顯差異，菌絲都非常濃密、潔白，邊緣較為整齊，氣生菌絲較強。但相較于2個菌株，真姬菇515的菌絲濃密度更為濃密，氣生菌絲更強，說明該新菌株提高了對氮源脅迫的抗性。

近些日子，楊力生與老婆的感情越來越生疏了。他的心就像冬天河里的水一樣漸漸凝滯，凍結(jié)起來，而每逢想起老婆那些惹他生氣的事，他心里就像著了火一樣難以平靜……

圖2　低氮加吐溫20培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.2Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on tween 20 medium（left）and morphological characteristics（right）

2.3高氮低碳培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

高氮低碳培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征見圖3。

由圖3可見，在高氮低碳的培養(yǎng)基中，第11天菌株515與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)特征無明顯差別，菌絲濃密度很低，氣生菌絲十分虛弱，邊緣較整齊。但灰蟹菇生長速度最快，直徑為6.55 cm；白玉菇生長速度最慢；而菌株515的生長速度比灰蟹菇稍慢，直徑為6.47 cm，與灰蟹菇相比無明顯差異（P＞0.05），但與白玉菇相比有明顯差異（P＜0.05），說明新菌株515對碳源脅迫抵抗力較強。

2.4高無機鹽培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

在高無機鹽培養(yǎng)基中，第11天菌株515的生長速度最慢，直徑為4.53 cm；灰蟹菇生長速度最快，直徑為6.87 cm；白玉菇次之。菌株515與2個菌株間有顯著差異（P＜0.05），見圖4。

由圖4可見，菌株515在相同的高無機鹽培養(yǎng)基中，與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)特征差異較小，白玉菇和灰蟹菇菌絲濃密度較低，菌絲很強，氣生菌絲強，邊緣整齊。而菌株515的菌絲雖然濃密，但邊緣不整齊，生長速度最慢，說明高無機鹽抑制了菌絲的生長。

圖3　高氮低碳培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.3Growth Diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on high nitrogen and low carbon medium（left）and morphological characteristics（right）

圖4　高無機鹽培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.4Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on high inorganic salt medium（left）and morphological characteristics（right）

2.5低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

由圖5可見，在低氮低碳低無機鹽的培養(yǎng)基中，第11天菌株515與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)特征差異較?。喊子窆?、灰蟹菇菌絲濃密度較高，菌絲較強，氣生菌絲較強，邊緣較整齊；而菌株515的菌絲濃密度更高，菌絲更強，氣生菌絲也比灰蟹菇更強，邊緣更加整齊。在菌株生長速度方面，灰蟹菇生長速度最快，直徑為6.39 cm；菌株515次之；白玉菇生長速度最慢，直徑為5.62 cm。菌株515與灰蟹菇相比有顯著差異（P＜0.05），與白玉菇相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖5　低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.5Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on low nitrogen，carbon and inorganic salt medium（left）and morphological characteristics（right）

2.6完全培養(yǎng)基中菌絲生長速度及形態(tài)特征

在完全培養(yǎng)基中，第11天灰蟹菇的生長速度最慢，直徑為5.19 cm；白玉菇生長速度最快，直徑為6.27 cm；菌株515次之，與2個菌株有顯著差異（P＜0.05），見圖6。

由圖6可見，菌株515在相同的完全培養(yǎng)基中，與白玉菇、灰蟹菇菌絲形態(tài)有明顯差異。白玉菇菌絲濃密度較高，菌絲較強，氣生菌絲較強，邊緣較整齊；灰蟹菇和白玉菇差異較小，但邊緣不整齊；菌株515的菌絲濃密度高，菌絲強，氣生菌絲強，邊緣比灰蟹菇整齊，但中間部分菌絲生長較弱。

圖6　完全培養(yǎng)基下515、白玉菇、灰蟹菇菌絲生長直徑（左）和形態(tài)（右）Fig.6Growth Diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on complete nutrition medium（left）and morphological characteristics（right）

3　討論

菌株515在不同的營養(yǎng)條件下均能生長，具有較好的抗逆性。氮源是合成細胞壁、核酸等重要物質(zhì)的原料，氮素濃度會影響食用菌生長發(fā)育［10］，低氮條件會抑制細胞分泌大量蛋白酶，從而形成不利于菌絲體生長環(huán)境。從試驗結(jié)果可以看出，在低氮培養(yǎng)基條件下菌株515不管是菌絲生長速度還是菌絲濃密度、菌絲強弱程度都比2個菌株差，說明菌株515對氮源脅迫適應(yīng)性較差。吐溫是一種表面活性劑，研究表明，表面活性劑可促進細菌和真菌的產(chǎn)酶，并具有延緩酶失活的作用［11］。在吐溫20培養(yǎng)基條件下，菌株515的生長情況比白玉菇好，可能是因為適當濃度下吐溫促進細胞分泌分解基質(zhì)的相關(guān)酶，從而提高了菌株515對氮源脅迫的抗性。

碳素是構(gòu)成食用菌細胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是食用菌生命活動所需要的主要能量來源［12］，低碳環(huán)境將不利于食用菌生長。在高氮低碳培養(yǎng)基中，可以看出，菌株515與兩菌株菌絲形態(tài)無明顯差異，但菌株515菌絲生長速度比白玉菇快，具有顯著差異，說明菌株515對碳源脅迫具有較好的抗性。

無機鹽是食用菌生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是構(gòu)成細胞的成分，作為酶的組成部分，具有調(diào)節(jié)氮化還原電位和激活酶的作用。有的無機鹽存在于細胞質(zhì)中以維持細胞滲透壓和調(diào)節(jié)pH值具有多方面的生理功能［12］。在高無機鹽培養(yǎng)基中，菌株515菌絲生長速度非常慢，但菌絲濃密程度比親本大，這可能是高無機鹽環(huán)境下導(dǎo)致菌體形態(tài)及生理生化發(fā)生改變，從而抑制菌株515的菌絲生長。

在低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基中，菌株515的菌絲生長速度雖然最慢，與灰蟹菇相比有顯著差異（P＜0.05），但與白玉菇相比無顯著差異（P＞0.05），且在菌絲形態(tài)生長上比兩菌株好，說明在營養(yǎng)較苛刻的情況下，菌株515的抗逆性較好。

在完全培養(yǎng)基下，菌株515的菌絲生長較兩菌株好，但中間部分的菌絲濃密度較低，原因有待進一步查明。

4　結(jié)論

新品種真姬菇515是由白玉菇和灰蟹菇的原生質(zhì)體融合選育而來，綜合了白玉菇和灰蟹菇的優(yōu)良品質(zhì)。真姬菇515的抗逆性在某些方面比親本好，但在某些方面與親本相比有些差距。真姬菇515是否適合工廠化生產(chǎn)還需要考慮其它因素，有待進一步進行試驗研究。

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Stress Resistance Analysis on New Strain of Hypsizygus marmoreus by Hybridization

CHEN Wen-xing，SHAN Shu-kai，LI Zhe，YE Zhi-bin，LAI Chun-fen，AI Liu-ying，ZHANG Liao-yuan，SUN Shu-jing，HU Kai-hui
（College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

The stress resistance of new strain 515 of Hypsizygus marmoreus breeded by mating of monokaryotic mycelia by hyphal fusion was analyzed by the determination of mycelia growth rate and characteristics under different limited nutritional conditions.The results showed the gray of H.marmoreus for a variety of nutritional stress had good resistance，and the new strain 515 of H.marmoreus showed poor adaptability on low nitrogen conditions，and the high inorganic salt inhibited the growth of mycelia，and the rate of growth of mycelia significantly higher than the gray of H.marmoreus and the morphology of hyphae pure white and dense as well as regular of edge，that showed it improved the stress resistance of new strain 515 of H.marmoreus for nitrogen source stress on tween 20 medium.However，the new strain mycelia growth faster than two starting strain in low carbon condition and had significant difference with the gray of H.marmoreus and had not significant difference with the white of H.marmoreus that showed the new strain had good resistance for carbon source stress，and it showed the new strain 515 had good applicable value because of H.marmoreus cultivation raw material was given priority to carbon source.

Hypsizygus marmorens；hybrid strains；mycelia morphology；mycelia growth rate；stress resistance analysis

S646.9

A

1003-8310（2016）03-0017-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.004

*項目來源：福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)五新工程項目（閩發(fā)改委投資［2012］931號）；福建省自然基金杰出青年項目（2014J06010）；福建農(nóng)林大學(xué)校杰出青年人才項目（xjq201209）；國家自然基金青年項目（31201669）；教育部博士點基金（20103515120015）；福建省政府專項項目（K8114002A）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大研發(fā)平臺（2014N2101）；福建省發(fā)改委生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)專項（2011878）。

陳文星（1991-），男，在讀碩士研究生，主要研究方向為食用真菌學(xué)。E-mail：799919670@qq.com

**通信作者：孫淑靜（1978-），女，博士，副教授，主要從事食（藥）用菌分子生物學(xué)、食用菌遺傳學(xué)、食用菌遺傳育種方面研究。E-mail：shjsun2004@126.com

2016-02-23