韓 平馮 俊陳華文
(1.湖北省秭歸縣人民醫(yī)院,湖北 秭歸 443600;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院,湖北 武漢 430030)
·研究報告·
丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注后細胞凋亡的機制研究*
韓 平1馮 俊2△陳華文2
(1.湖北省秭歸縣人民醫(yī)院,湖北 秭歸 443600;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院,湖北 武漢 430030)
目的 探索丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注后細胞凋亡的機制。方法 選取32只SD大鼠,按隨機數字表法分為假手術組、模型組、丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組,每組8只。丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組分別于術前7 d開始給予20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液腹腔注射。假手術組、缺血再灌注模型組均給予等量蒸餾水腹腔注射。采用結扎左前降支法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。各組于造模后3 h剪取心臟組織,采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡,Western bolt法檢測p-Akt表達,免疫組化法檢測Mfn2表達。結果 與假手術組相比較,模型組心肌細胞凋亡指數、Mfn2表達顯著升高,p-Akt表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比較,丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組心肌細胞凋亡指數、Mfn2表達顯著降低,p-Akt表達顯著升高(P<0.05),并顯示出明顯劑量依賴性。結論 丹參酮ⅡA可有效抑制心肌缺血再灌注損傷后的心肌細胞凋亡,抑制Mfn2表達是其可能的作用機制。
丹參酮ⅡA 缺血再灌注 心肌細胞 細胞凋亡 線粒體融合素2
心肌細胞凋亡是導致心肌缺血再灌注(I/R)后心功能不全及心律失常的主要因素[1]。線粒體融合素(Mfn2)及其產物具有負向調控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的作用,從而在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[2]。丹參酮ⅡA可通過激活PI3K/Akt信號通路,介導細胞增殖、凋亡過程,從而發(fā)揮心肌保護、抗動脈粥樣硬化等作用[3]。但丹參酮ⅡA對Mfn2的調控作用尚未明確。針對上述問題,研究選取心肌缺血再灌注損傷模型大鼠為研究對象,觀察辛伐他汀對心肌凋亡及Mfn2表達的影響,探討丹參酮ⅡA抗心肌細胞凋亡的作用機制,為臨床應用提供可靠依據。現(xiàn)報告如下。
1.1 材料 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(諾新康;上海第一生化藥業(yè)有限公司產品,國藥準字H31022558);DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶(美國Gibco公司);Mfn2抗體、p-Akt抗體、Akt抗體(美國Santa Cruz公司);免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司);凋亡檢測試劑盒(TUNEL法,德國Roche公司)。
1.2 實驗動物 健康成年SD大鼠32只,雄性,SPF級,體質量220~270 g,購于同濟醫(yī)學院動物實驗中心(動物合格證號:SCXK鄂2009-0003)。
1.3 分組與造模 將受試大鼠按隨機數字表法分為4組,即假手術組、模型組、丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組,每組8只。丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組分別于術前7 d開始給予20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液腹腔注射。假手術組、缺血再灌注模型組均給予等量蒸餾水腹腔注射。大鼠采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉,采用小動物呼吸機鼻面罩輔助通氣,常規(guī)開胸,逐層分離胸膜、心包,于左心耳下緣、肺動脈圓錐水平縱軸上,以縫線穿圓形塑料套管結扎模型組、5 mg辛伐他汀組、10 mg辛伐他汀組大鼠左前降支并阻斷血流。血流阻斷成功標準:1)遠端心肌出現(xiàn)蒼白;2)心電圖標準Ⅱ導聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上型抬高。阻斷成功30 min后,剪開空心塑管,恢復血流,之后逐層關閉胸腔。假手術組開胸后于左前降支下穿線,但并不結扎。再灌注3 h后,常規(guī)取出心臟標本。
1.4 標本采集與檢測 1)TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡。上述心臟標本以4%多聚甲醛固定24 h,梯度酒精脫水,石蠟包埋后切片。采用TUNEL法對切片進行染色,操作嚴格按試劑盒說明書進行,以細胞核染成棕黃色為陽性,每張切片于缺血再灌注損傷區(qū)域(假手術組于左室前壁區(qū)域)隨機選取5個視野,記錄陽性細胞數,并計算細胞凋亡指數(AI),AI(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。2)Western bolt法檢測p-Akt表達。采用Western blot法檢測心肌組織中p-Akt蛋白表達。常規(guī)提取組織蛋白,行SDS-PAGE電泳,轉至硝酸纖維膜,5%封閉液4℃封閉4 h,TBS緩沖液漂洗3次,加入相應一抗(抗p-Akt、抗Akt、抗α-actin)(1∶1000),4℃孵育過夜,TBS緩沖液漂洗3次,加入相應二抗(1∶500),室溫孵育2 h,增強化學發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。3)免疫組化法檢測 Mfn2表達。上述心臟標本以4%多聚甲醛固定24 h,梯度酒精脫水,石蠟包埋后切片,采用免疫組化法檢測Mfn2表達。嚴格按試劑盒操作說明進行,每張切片于缺血再灌注損傷區(qū)域(假手術組于左室前壁區(qū)域)隨機選取5個視野,采用虛擬顯微鏡拍攝圖片,使用圖像分析軟件測定Mfn2表達平均吸光度值。
1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以(±s)表示,多組間比較用單因素方差檢驗,兩兩間比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 各組心肌細胞凋亡情況比較 見表1、圖1。TUNEL染色結果顯示,正常心肌細胞核呈藍色,凋亡心肌細胞核呈棕黃色。假手術組未見心肌細胞凋亡;與假手術組相比較,模型組心肌細胞AI顯著升高(P<0.05);與模型組相比較,丹參酮ⅡA組心肌細胞AI顯著降低,且丹參酮ⅡA40mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著(P<0.05)
圖1 各組心肌細胞凋亡情況比較(TUNEL染色,400倍)
表1 各組心肌細胞凋亡情況比較(%,±s)
表1 各組心肌細胞凋亡情況比較(%,±s)
與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與丹參酮ⅡA 20 mg組比較,▲P<0.05。下同。
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2.2 各組p-Akt蛋白表達水平比較 見表2,圖2。Western bolt檢測結果顯示,與假手術組相比較,模型組心肌p-Akt蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比較,丹參酮ⅡA組心肌p-Akt蛋白表達顯著增高,且丹參酮ⅡA 40 mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著(P<0.05)。
2.3 各組Mfn2蛋白表達水平比較 見表3,圖3。免疫組化檢測結果顯示,與假手術組相比較,模型組心肌Mfn2蛋白表達顯著增高(P<0.05);與模型組相比較,丹參酮ⅡA組心肌Mfn2蛋白表達顯著降低,且丹參酮ⅡA 40 mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著(P<0.05)。
圖2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較
表2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較(±s)
表2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較(±s)
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圖3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較(免疫組化,200倍)
表3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較(±s)
表3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較(±s)
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心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷過程中的標志性事件,其發(fā)生機制較為復雜,主要由缺血、缺氧及氧化應激等多種因素激活促凋亡基因、調控相關信號通路引起[4]。Ras-PI3K/Akt信號通路作為關鍵路徑在促發(fā)心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,調節(jié)該信號通路相關基因表達,抑制心肌細胞凋亡,已成為預防心肌缺血再灌注損傷的新方向[5]。
丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分之一,具有調節(jié)血脂、抗血栓及延緩動脈粥樣硬化等作用,并被廣泛應用于心血管疾病的治療。近年來隨著研究的深入,丹參酮ⅡA的細胞保護作用也日益受到關注[6]。研究證實,丹參酮ⅡA可通過抑制甲羥戊酸合成,阻礙小三磷酸鳥苷結合蛋白Ras異戊二烯化,調控Ras-PI3K/Akt信號通路及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,促進一氧化氮(NO)釋放,減少活性氧(ROS)生成,具有顯著的抗氧化、抗炎及抑制血管內皮細胞和心肌細胞凋亡的作用[7]。但丹參酮ⅡA對Mfn2信號通路上游信號分子的調控作用尚未完全明確。
Mfn2屬于線粒體外膜蛋白,是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞信號通路調控點[8]。周煒等研究顯示,血管平滑肌細胞中的Mfn2可通過線粒體途徑對原癌基因Ras起到直接負調控作用,從而阻滯Ras-PI3K/Akt信號通路,抑制Akt磷酸化,進而抑制包括Bcl-2在內的促凋亡基因表達,促進包括Bax在內的抑凋亡基因表達,提示Mfn2在Ras-PI3K/Akt上游信號通路中起著關鍵的促凋亡作用[9]。但Mfn2在缺血再灌注損傷后心肌凋亡中的調控作用尚未明確。
本研究結果顯示,急性心肌缺血再灌注損傷后,大鼠心肌組織切片缺血再灌注損傷區(qū)域可見Mfn2呈現(xiàn)高表達,而p-Akt呈現(xiàn)低表達,同時該區(qū)域內心肌細胞大量凋亡,提示心肌缺血再灌注損傷可能通過激活Mfn2表達,抑制Akt磷酸化,從而促進心肌細胞凋亡[10]。與模型組相比較,于術前采用丹參酮ⅡA進行干預,可顯著抑制心肌細胞凋亡、下調Mfn2表達、上調p-Akt表達,且丹參酮ⅡA的調控作用呈現(xiàn)明顯劑量依賴性,提示丹參酮IIA可能通過抑制促凋亡基因Mfn2表達,調控Ras-PI3K/Akt信號通路,進而達到抑制心肌細胞凋亡的作用[11-15]。
綜上所述,Mfn2可能在心肌缺血再灌注損傷過程中起到促心肌細胞凋亡作用,而丹參酮ⅡA可通過抑制Mfn2表達,抑制心肌缺血再灌注損傷后的心肌細胞凋亡,從而實現(xiàn)其心肌保護作用。丹參酮ⅡA是否還通過其他信號分子或信號通路發(fā)揮心肌保護作用,仍有待進一步深入研究。
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The Effect of TanshinoneⅡA on Cardiomyocyte Apoptosis after Myocardial Ischemia/Reperfusion Injuryin Rats
HAN Ping,F(xiàn)ENG Jun,CHEN Huawen.Zigui People′s Hospital,Hubei,Zigui 443600,China.
Objective:To evaluate the effect of TanshinoneⅡA on cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into sham-operation group,model group,20 mg TanshinoneⅡA group and 40mg TanshinoneⅡA group,8 rats in each group.The 20mg TanshinoneⅡA group and the 40mg TanshinoneⅡA group respectively were given 20 mg/(kg·d)and 40 mg/(kg·d)TanshinoneⅡA intraperitoneal injection 7d before the operation.The sham-operation group and the model group were given equivalent normal saline intraperitoneal injection.The myocardial ischemia/reperfusion injury model was induced by ligation of left anterior descending artery.In 3h after reperfusion,the hearts of each group rats were harvested.The cardiomyocyte apoptosis was detected by TUNEL method,the p-Akt expression was detected by western bolt,and the Mfn2 expression was detected by immunohistochemistry method.Results:Compared with the sham-operation group,the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of model group significantly increased,and the p-Akt expression significantly decreased(P<0.05).Compared with the model group,the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of the 20 mg TanshinoneⅡA group and the 40 mg TanshinoneⅡA group significantly decreased,and the p-Akt expression significantly increased(P<0.05),and showed significantly dose-dependent manner(P<0.05).Conclusion:TanshinoneⅡA can inhibit the cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury,and down-regulating the expression of Mfn2 may be its mechanism.
TanshinoneⅡA;Ischemia/reperfusion;Cardiomyocyte;Apoptosis;Mitofusin
·研究報告·
R285.5
A
1004-745X(2016)10-1844-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.004
國家自然科學基金項目(81202825)
△(電子郵箱:andyterry555@163.com)
(2016-02-13)