吳亞楠，梁曉春，楊 丹，屈 嶺，劉 偉，高云周

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730

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·論 著·

中藥筋脈通對(duì)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)硝基酪氨酸和神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

吳亞楠，梁曉春，楊 丹，屈 嶺，劉 偉，高云周

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730

目的 觀察中藥復(fù)方筋脈通(JMT)對(duì)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)硝基酪氨酸(NT)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)的影響。方法 采用鏈脲佐菌素一次性腹腔內(nèi)注射方法造模，隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組(Con組)、糖尿病模型對(duì)照組(DM組)、JMT治療組(JMT組)及?；撬嶂委熃M(Tau組)4組，每組10只。成模后給予灌胃給藥，JMT組[1.31 g/(kg·d)，給藥劑量為生藥量]及Tau組[1.20 g/(kg·d)]均按成人劑量15倍給藥，DM組和Con組灌服蒸溜水l ml/(100 g·d)。分別于治療前及治療后4、8、12、16周檢測(cè)各組大鼠體重和血糖變化。所有大鼠均于灌胃16周后進(jìn)行機(jī)械痛閾檢測(cè)后處死，取大鼠DRG組織，采用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測(cè)大鼠DRG中NT 及NGF的表達(dá)。結(jié)果 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，DM組的NT表達(dá)顯著升高(P=0.000)，NGF的表達(dá)顯著降低(P=0.006)；與DM組相比，JMT組及Tau組的NT表達(dá)顯著降低(P=0.000，P=0.000)，NGF表達(dá)顯著升高(P=0.000，P=0.004)，其中JMT治療組NT較Tau組更為顯著(P=0.004)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，DM組的NT蛋白表達(dá)顯著升高(P=0.000)，NGF蛋白表達(dá)顯著降低(P=0.000)；與DM組比較，JMT組與Tau組的NT蛋白表達(dá)均顯著降低(P=0.001，P=0.000)，NGF蛋白表達(dá)均顯著升高(P=0.000，P=0.001)。結(jié)論 中藥JMT能夠增加糖尿病大鼠DRG組織中NGF的表達(dá)，同時(shí)降低NT水平。

糖尿病周圍神經(jīng)病變；背根神經(jīng)節(jié)；免疫組織化學(xué)；Western blot檢測(cè)；硝基酪氨酸；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；筋脈通

ActaAcadMedSin，2016,38(5)：507-513

硝化應(yīng)激是包括糖尿病及其并發(fā)癥在內(nèi)多種疾病重要的發(fā)病途徑[1]，硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)是體內(nèi)硝化應(yīng)激存在的有力證據(jù)。神經(jīng)的修復(fù)再生障礙是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)發(fā)病中另一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)可以促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)與再生。研究表明，硝化應(yīng)激可以導(dǎo)致NGF的表達(dá)異常[2]。既往研究中已發(fā)現(xiàn)中藥筋脈通(Jingmaitong，JMT)能夠抑制氧化應(yīng)激[3]，增加NGF表達(dá)[4]，本研究觀察了JMT對(duì)糖尿病大鼠DRG組織中NT及NGF表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步了解JMT的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重270～310 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京)2009- 0017。JMT膠囊(主要由女貞子、菟絲子、桂枝、細(xì)辛、元胡、水蛭等藥物組成)為北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)，每粒含生藥0.35 g，批準(zhǔn)文號(hào)(97)京衛(wèi)藥制加字[48]第F- 292號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)061019。?；撬?taurine，Tau)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)T4571，1000 g/瓶；精蛋白鋅胰島素注射液購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，400 U/10 ml，批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H32024565，生產(chǎn)批號(hào)080314；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，兔抗大鼠NT多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioss公司，兔抗大鼠NGF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

模型建立及分組 雄性SD大鼠飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)環(huán)境，溫度22℃(20～25℃)，濕度45%(40%～70%)，每日光照12 h(7∶00- 19∶00)，噪音<60分貝。以大鼠維持飼料(碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪4.0%)飼養(yǎng)，自由飲水，分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和造模組。對(duì)造模組大鼠按60 mg/kg體重的劑量，一次性左下腹腔內(nèi)注射0.45%的STZ溶液。Con組按60 mg/kg體重的劑量，一次性左下腹腔內(nèi)注射0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液。72 h后用血糖儀測(cè)尾尖血血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L者為造模成功，作為DM大鼠。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的30只DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型對(duì)照組(DM組)、JMT治療組(JMT組)及?；撬嶂委熃M(Tau組)3組，每組10只。腹腔內(nèi)注射枸櫞酸鹽緩沖液的大鼠，72 h后測(cè)尾尖靜脈血血糖，凡血糖<7.0 mmol/L者，作為正常對(duì)照組(Con組)，共10只，體重與鼠齡均相匹配。造模成功后開(kāi)始灌胃給藥：(1)JMT組：按成人劑量15倍給藥，即1.31 g/(kg·d)，給藥劑量為生藥量；(2)Tau組：按成人劑量15倍給藥，即1.20 g/(kg·d)；以上藥物均用蒸餾水定期配制，4 ℃冰箱中保存，每日灌胃1次。DM組和Con組則灌服等體積蒸餾水，每日灌胃劑量1 ml/100 g體重。各組連續(xù)灌胃16周。為防止大鼠因血糖過(guò)高而無(wú)法存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第4周后，根據(jù)實(shí)測(cè)大鼠血糖情況，給予精蛋白鋅胰島素注射液1～3 U每日1次皮下注射，維持血糖小于30.0 mmol/L。

一般情況、血糖及體重檢測(cè) 觀察大鼠的毛色、精神狀態(tài)、攝食、體重及日常活動(dòng)情況等。分別于治療前，治療后4、8、12、16周取尾尖血，用血糖儀測(cè)定血糖，每次測(cè)血糖前均稱體重。

機(jī)械痛閾值的測(cè)定 采用Von Frey電子測(cè)痛儀(IITC公司，美國(guó))，在干預(yù)16周后處死大鼠前進(jìn)行機(jī)械痛閾值的測(cè)定。將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩。先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境10～15 min，然后用電子Von Frey儀的探頭纖維垂直剌激大鼠后肢足底中部，使探頭纖維稍成S形，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)。大鼠在刺激后出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽(yáng)性反應(yīng)，并記錄電子屏幕上的受力數(shù)值(g)。身體活動(dòng)所引起的縮足反應(yīng)則不記作陽(yáng)性反應(yīng)。每間隔3～5 min測(cè)量1次，每只大鼠每側(cè)足底測(cè)量3次并記錄。

標(biāo)本處理 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均連續(xù)灌胃16周后處死。用12%的烏拉坦以1 ml/100 g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉后俯臥位固定，于股骨干后外側(cè)剪開(kāi)皮膚，大鼠股外側(cè)肌間隙進(jìn)入，暴露坐骨神經(jīng)，用玻璃分針鈍性分離，沿坐骨神經(jīng)向遠(yuǎn)心端方向?qū)⑸窠?jīng)用力完整拉出，找到膨大的背根神經(jīng)節(jié)，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，送至中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)病理中心，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，烤干后4 ℃保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；另取組織置于凍存管內(nèi)，迅速投入液氮中冷凍轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存，用于Western blot檢測(cè)。

免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)DRG組織中NT和NGF的表達(dá) DRG組織石蠟包埋、切片，50～60 ℃烤干過(guò)夜，常規(guī)脫蠟，置枸櫞酸溶液(pH 6.0)中，92～98 ℃加熱10 min，置于室溫15 min冷卻，PBS沖洗2次，置3% H2O2中，室溫10 min。PBS沖洗后，滴加5% BAS，室溫孵育20 min，除去多余液體。滴加一抗即兔抗大鼠NT多克隆抗體稀釋液150 μl(1∶400稀釋)，37 ℃孵育60 min。陰性對(duì)照滴加0.01 mol/L PBS代替一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PBS沖洗后滴加已生物素化的二抗即羊抗兔IgG 150 μl，37 ℃孵育20 min。經(jīng)PBS沖洗后滴加SABC 150 μl，37 ℃孵育20 min。滴加150 μl新鮮配制的DAB溶液，鏡下觀察35 s后即出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染40 s，蒸餾水沖洗。常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)脂封片。組織被染為棕黃色，細(xì)胞核被染為藍(lán)色視為陽(yáng)性。通過(guò)Leica顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，對(duì)采集的免疫組織化學(xué)圖像結(jié)果進(jìn)行分析。測(cè)量積分光密度(integrated optical density，IOD)值，進(jìn)一步計(jì)算出陽(yáng)性區(qū)域平均光密度(average optical density，AOD)值，對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

Western blot法測(cè)定DRG的NT和NGF蛋白表達(dá)

組織蛋白的提?。喝⌒迈rDRG組織，剪碎后加入200 μl細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，放置于冰上。每隔5 min振蕩1次，充分裂解后，收集懸液，離心收集的上清即為總蛋白，轉(zhuǎn)移分裝至另一Eppendorf管中，-80 ℃保存。

BCA法測(cè)定總蛋白濃度：用蒸餾水稀釋各組待測(cè)蛋白樣品(20倍稀釋)。取BCA試劑盒A液和B液適量以50∶1的比例混勻形成淺綠色工作液。將20 μl不同濃度梯度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋好的待測(cè)蛋白樣品分別與400 μl工作液混合，37 ℃水浴反應(yīng)30 min。將反應(yīng)后的蛋白溶液分別取200 μl(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔)加入到96孔板中，振蕩30 s。測(cè)定吸光度：酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)562 nm測(cè)量A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。20倍稀釋后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及吸光值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終的待測(cè)蛋白實(shí)際濃度為測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)(20倍)。

Western blot檢測(cè)：制備SDS-PAGE，將凝膠板固定于電泳裝置內(nèi)，加入電極緩沖液。將相同質(zhì)量的待測(cè)樣品(總蛋白80 μg)，根據(jù)已測(cè)定的各樣品的蛋白濃度，計(jì)算各個(gè)樣品所需體積。與5倍體積的loading buffer混勻，沸水煮5 min后放入冰盒中速冷。順序吸取蛋白樣品至加樣孔內(nèi)，其中兩側(cè)為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，開(kāi)始時(shí)電壓為70 V，電泳10 min后轉(zhuǎn)為100 V，待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。電泳結(jié)束后冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，接通電源350 mA，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小轉(zhuǎn)膜約45～90 min。將膜浸入用TBS-T配制5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。用封閉液將一抗按1∶1000稀釋，β-Actin為1∶1000，將膜與一抗一起孵育，用TBS-T于搖床上4 ℃過(guò)夜。用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比例1∶3000)，將稀釋后的二抗與膜室溫孵育60 min。用TBS-T于搖床上清洗。然后用ECL進(jìn)行顯色反應(yīng)，暗室內(nèi)轉(zhuǎn)印膜對(duì)X感光膠片曝光。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析蛋白條帶，以目的蛋白的灰度(目的蛋白的IOD值/相應(yīng)內(nèi)參蛋白β-actin的IOD值)作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包，完成數(shù)據(jù)錄入后進(jìn)行資料復(fù)查整理。分析前采用One Sample Kolmogorov-Smirnov Test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析，并進(jìn)一步行均數(shù)的兩兩比較；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(k個(gè)獨(dú)立樣本的檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況觀察、血糖和體重 Con組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色純白有光澤，進(jìn)食和飲水量以及尿量都正常，體重增長(zhǎng)，動(dòng)作自如。模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿，神態(tài)萎靡，毛色枯黃無(wú)光澤，尾巴有褐色花斑，下腹部鼓脹，豎毛弓背，活動(dòng)少，體重增長(zhǎng)緩慢。各治療組大鼠有類似模型組的表現(xiàn)，但程度相對(duì)較輕。造模后4周，JMT組及Tau組各有1只大鼠死亡，尸體解剖未能明確死亡原因；造模后8周，DM組有2只大鼠死亡，發(fā)現(xiàn)時(shí)尸體已經(jīng)僵硬，也未能明確死亡原因。

與Con組相比，造模各組大鼠的血糖在各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P均<0.05)，各治療組血糖在同一時(shí)間點(diǎn)與DM組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，兩治療組間血糖在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(圖1)。

干預(yù)前后，同一時(shí)間點(diǎn)各治療組大鼠之間的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。給藥4、8、12、16周，各造模組的體重與Con組相比明顯下降(P均<0.05)(圖2)。

JMT對(duì)糖尿病大鼠機(jī)械痛閾值的影響 Con組、DM組、JMT組和Tau組大鼠左側(cè)機(jī)械痛閾值分別為(90.77±14.64)、(40.61±11.12)、(74.35±12.08)和(73.22±8.06)g，其中，DM組明顯低于Con組(P=0.000)，JMT組(P=0.001)和Tau組(P=0.001)明顯高于DM組，JMT組和Tau組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.829)；右側(cè)機(jī)械痛閾值分別為(92.12±10.03)(42.45±8.77)、(78.56±14.76)和(79.43±12.37) g，其中,DM組明顯低于Con組(P=0.000)，JMT組(P=0.000)和Tau組(P=0.000)明顯高于DM組，JMT組和Tau組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.961)。

Con：正常對(duì)照組；DM：糖尿病模型對(duì)照組；JMT：筋脈通治療組；Tau：?；撬嶂委熃M

Con：normal control group；DM：diabetes mellitus group；JMT：Jinmaitong group；Tau：taurine group

與Con組比較，aP<0.05

aP<0.05 compared with Con group

圖 1 各組大鼠治療前后血糖變化

Fig 1 Changes of blood glucose level in each group before and after treatment

與Con組比較，aP<0.05

aP<0.05 compared with Con group

圖 2 各組大鼠治療前后體重變化

Fig 2 Changes of body weight in each group before and after treatment

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 Con組、DM組、JMT組和Tau組大鼠NT的AOD值分別為(6.58±0.48)×10-2、(15.72±0.73)×10-2、(7.28±0.88)×10-2和(9.67±0.79)×10-2，NGF的AOD值分別為(7.94±0.61)×10-2、(4.76±0.50)×10-2、(8.12±0.65)×10-2和(6.88±0.67)×10-2，其中,DM組的NT明顯高于Con組(P=0.000)，NGF明顯低于Con組(P=0.006)；JMT組及Tau組的NT明顯低于DM組(P=0.000，P=0.000)，NGF明顯高于DM組(P=0.000，P=0.004)；JMT組NT明顯低于Tau組(P=0.004)，NGF明顯高于Tau組(P=0.037)； JMT組的NT(P=0.273)及NGF(P=0.120)表達(dá)與Con組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、4)。

Weston blot檢測(cè)結(jié)果 Con組、DM組、JMT組和Tau組大鼠的NT蛋白表達(dá)分別為0.69±0.01、0.85±0.03、0.72±0.04和0.79±0.02，NGF蛋白表達(dá)分別為1.00±0.01、0.24±0.03、0.39±0.01和0.32±0.03，其中，DM組的NT明顯高于Con組(P=0.000)，NGF明顯低于Con組(P=0.000)；JMT組及Tau組的NT明顯低于DM組(P=0.001，P=0.000)，NGF明顯高于DM組(P=0.000，P=0.001)；JMT組的NGF明顯高于Tau組(P=0.004)； JMT組(P=0.026,P=0.000)和Tau組(P=0.000,P=0.000)的NT和NGF與Con組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

DRG：背根神經(jīng)節(jié)；NT：硝基酪氨酸

DRG：dorsal root ganglion；NT：nitrotyrosine

A.Con；B.DM；C.JMT；D.Tau

圖 3 大鼠DRG中NT的免疫組織化學(xué)染色(×200)

Fig 3 Immunohistochemical staining of NT in DRG of rats (×200)

NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子

NGF：nerve growth factor

A.Con；B.DM；C.JMT；D.Tau

圖 4 大鼠背根神經(jīng)節(jié)NGF的免疫組織化學(xué)染色(×200)

Fig 4 Immunohistochemical staining of NGF in DRG of rats(×200)

討 論

DPN是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，遠(yuǎn)端多發(fā)對(duì)稱性神經(jīng)病變 (distal symmetric polyneuropathy，DSP)是其最常見(jiàn)的臨床類型。大量研究已表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)的產(chǎn)生及過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)的形成所導(dǎo)致的硝化應(yīng)激是包括DSP在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因[5]。NO是人體生理及病理過(guò)程中重要的介質(zhì)。糖尿病時(shí)炎性介質(zhì)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)廣泛表達(dá)產(chǎn)生過(guò)量NO，同時(shí)糖尿病時(shí)氧化應(yīng)激致O2-的產(chǎn)生增多[6]。由于NO 與O2-反應(yīng)的速度是正常狀態(tài)下超氧化物歧化酶與O2-反應(yīng)速度的3倍，使得NO首先與O2-發(fā)生快速非酶促化反應(yīng)生成ONOO-。ONOO-是一種強(qiáng)氧化劑，較NO及O2-具有更高的活性及細(xì)胞毒性，是糖尿病等疾病發(fā)生氧化及硝化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)主要的氧化劑[7- 8]，也是NO產(chǎn)生病理?yè)p傷的主要環(huán)節(jié)。ONOO-能直接導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA 鏈斷裂、酶活性滅活，干擾信號(hào)傳導(dǎo)通路[9]，使線粒體功能障礙，并干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡[7- 8,10]。這些均是導(dǎo)致糖尿病周圍感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及微血管功能障礙的原因[11]。此外，研究表明NO 還與軸索及髓鞘損傷及再生修復(fù)直接相關(guān)。局部過(guò)量產(chǎn)生的NO能損傷軸索，影響髓鞘的再生及修復(fù)，即便是低劑量慢性NO增加也能導(dǎo)致周圍神經(jīng)的損傷及糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生[12- 13]。由于ONOO-極不穩(wěn)定，生成后即與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝化反應(yīng)，生成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物NT，所以NT被公認(rèn)是ONOO-生成的穩(wěn)定的生物學(xué)標(biāo)志[14]，是硝化應(yīng)激存在的有力證據(jù)。研究表明，DSP患者血液中NT濃度增加，且NT存在于糖尿病周圍神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞中[15]。

圖 5 各組DRG組織中NT、NGF蛋白表達(dá)結(jié)果

Fig 5 The expressions of NT and NGF in DRG of each group

NGF是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，不僅能夠保護(hù)神經(jīng)元，而且能夠促進(jìn)神經(jīng)的再生和修復(fù)[16]。病理狀態(tài)下NGF水平的降低可導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙或死亡[17]。研究表明，糖尿病時(shí)NGF表達(dá)降低，影響了神經(jīng)的修復(fù)再生[18]。硝化應(yīng)激及NGF均可影響到神經(jīng)的修復(fù)及再生，那么兩者之間有什么關(guān)系呢？研究發(fā)現(xiàn)，硝化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的ONOO-可以損傷感覺(jué)神經(jīng)元中NGF信號(hào)通路，使NGF信號(hào)通路中TrkA受體硝基化及p75NTR表達(dá)增加，使NGF發(fā)生異常[2]，從而影響了神經(jīng)的修復(fù)及再生。

本課題組多年研究發(fā)現(xiàn)，腎虛血瘀、筋脈不通是DPN的主要證型，并研制了復(fù)方中藥JMT。JMT是由菟絲子、女貞子、水蛭、元胡、桂枝、細(xì)辛等組成，其中菟絲子和女貞子溫陽(yáng)育陰、陰陽(yáng)俱補(bǔ)；元胡和水蛭活血化瘀；桂枝、細(xì)辛溫經(jīng)通脈。全方共奏補(bǔ)腎活血、溫經(jīng)通脈之功，臨床取得良好的療效。Tau是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最為豐富的游離氨基酸之一，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)末梢均含有豐富Tau。Tau作為抗氧化劑，對(duì)神經(jīng)組織損傷具有各種保護(hù)作用，研究證明Tau通過(guò)抑制氧化應(yīng)激作用而減輕包括DPN在內(nèi)的糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)展[19]，故本研究選用Tau作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

本研究從動(dòng)物模型的建立，灌胃給藥、取材等均依據(jù)課題組既往研究的經(jīng)驗(yàn)及成果。既往研究曾經(jīng)觀察到成模后8周的STZ-DM大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢[20]，成模16周DM大鼠甩尾潛伏期顯著延長(zhǎng)、痛閾值顯著降低[4]。本研究結(jié)果也顯示成模16周DM大鼠機(jī)械痛閾值顯著降低，與既往研究結(jié)果一致，提示STZ-DM大鼠出現(xiàn)了痛覺(jué)過(guò)敏，說(shuō)明動(dòng)物模型存在感覺(jué)神經(jīng)纖維受累。本研究觀察到，JMT組血糖與DM組及Tau組比較，雖有偏低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明JMT對(duì)糖尿病大鼠DRG中NT及NGF的影響可能不是通過(guò)降低血糖實(shí)現(xiàn)的。

DRG作為感覺(jué)傳入的第1級(jí)神經(jīng)元在痛覺(jué)的作用機(jī)制中占有重要地位。在糖尿病出現(xiàn)6個(gè)月后，DRG就可出現(xiàn)顯著變化[21]。本研究選擇DRG作為研究對(duì)象，并采用免疫組織化學(xué)法及Western blot法對(duì)DRG組織NT及NGF進(jìn)行檢測(cè)。因NT是酪氨酸硝基化產(chǎn)物，沒(méi)有直接編碼的mRNA，所以沒(méi)有進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，DM組大鼠DRG組織中NT 的表達(dá)明顯升高，NGF水平明顯下降，證實(shí)了糖尿病狀態(tài)下DRG組織中硝化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，同時(shí)NGF水平顯著下降。經(jīng)JMT及Tau治療16周后，兩組NT的表達(dá)均顯著下降，說(shuō)明JMT及Tau均可抑制糖尿病大鼠DRG組織中NT的表達(dá)，減輕硝化應(yīng)激反應(yīng)，且JMT的作用優(yōu)于抗氧化劑Tau。同時(shí)，JMT能夠使NGF表達(dá)顯著升高，這有可能是通過(guò)減少NT的產(chǎn)生，抑制硝化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，可能是JMT治療DPN的機(jī)制之一。

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Effects of Chinese Medicinal Compound Jinmaitong on the Expression of Nitrotyrosine and Nerve Growth Factor in the Dorsal Root Ganglia of Diabetic Rats

WU Ya-nan，LIANG Xiao-chun，YANG Dan，QU Ling，LIU Wei，GAO Yun-zhou

Department of TCM，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

LIANG Xiao-chun Tel：010- 69155331，E-mail：xcliang@vip.sina.com

Objective To study the effects of Chinese medicinal compound Jinmaitong(JMT) on the expressions of nitrotyrosine (NT) and nerve growth factor (NGF) in dorsal root ganglia of diabetic rats. Methods Experimental rat diabetic models were established by the intraperitoneal injection of streptozotocin. Rat models were then randomly divided into four groups including normal control group (Con group)，diabetes mellitus group (DM group)，Jinmaitong group(JMT group)(treated with JMT similar to the fifteen-fold dose of adult recommended dosage)，and taurine group(Tau group)(treated with Taurine similar to the fifteen-fold dose of adult recommended dosage)，with 10 rats in each group. The Con and DM groups were treated with distilled water at a daily dose of 1 ml/100 g. All rats were given intragastric administration for 16 weeks and then killed. Body weight and blood glucose were detected before and at the 4th，8th，12th，and 16th week after treatment. The pain threshold to mechanical stimulation with von Frey filament were carried out before death. The expressions of NT and NGF in dorsal root ganglion were detected by immunohistochemistry and Western blot analysis，respectively. Results Immunohistochemistry showed that the average optical density (AOD) of NT expression in DM group were significantly higher than those in control group (P=0.000)，and the AOD of NGF was significantly lower than the control group (P=0.006).The AOD of NT(P=0.000,P=0.000) in both treatment groups decreased significantly and the AOD of NGF(P=0.000，P=0.004)significantly increased compared with DM group. The AOD of NT in JMT group was significantly lower than Tau group (P=0.004). Western blot analysis showed that the protein level of NT in DM group was significantly higher than that in control group (P=0.000)，and the protein level of NGF was significantly lower than that in control group (P=0.000). Compared with the DM group，the protein level of NT in both treatment groups significantly decreased (P=0.001，P=0.000)，and the protein level of NGF increased significantly (P=0.000，P=0.001). Conclusion Traditional Chinese medicine JMT can obviously up-regulate the expressions of NGF and reduce the NT levels in dorsal root ganglia of diabetic rats.

diabetic peripheral neuropathy； dorsal root ganglion； immunohistochemistry； Western blot analysis； nitrotyrosine； nerve growth factor；Jingmaitong capsule

北京市自然科學(xué)基金(7122147)Supported by the Beijing Natural Science Foundation(7122147)

梁曉春 電話：010- 69155331，電子郵件：xcliang@vip.sina.com

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2015- 09- 21)