喬鐵+梁可+馬進+林蔗茹+鄭冰元+張立德

[摘要]探討黃芪皂苷對化療貧血小鼠PI3K/Akt/mTOR相關基因mRNA表達的影響。選取6～7周齡BALB/c小鼠48只，雄性，隨機分為空白組、模型組、皂苷組、甲苷組，每組12只。采用環(huán)磷酰胺建立化療貧血模型，灌胃治療14 d后，摘眼球取血，QPCR法檢測脾臟中Akt，PI3K，BCL-xl，bad，F(xiàn)oxO，mTOR，PTEN的mRNA水平。結果表明，模型組血紅細胞計數(shù)，血紅蛋白含量與空白組、皂苷組和甲苷組比較，明顯降低（P<0.05）。與空白組、皂苷組、甲苷組相比，模型組Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷組這5種基因水平均較空白組無明顯差別；除PI3K外的4種基因，甲苷組較空白組有明顯差別（P<0.05或P<0.01）；而皂苷組與甲苷組水平也有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。模型組與空白組、皂苷組相比，F(xiàn)oxO，PTEN水平明顯升高（P<0.05或P<0.01），較甲苷組無明顯差異；甲苷組這2種基因水平均較空白組升高顯著（P<0.05）；而皂苷組的FoxO高于空白組（P<0.05），皂苷組的PTEN與空白組無明顯差異；皂苷組FoxO，PTEN水平與甲苷組無統(tǒng)計學意義。因此，該研究結果顯示黃芪皂苷能提高Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平（P<0.01），降低 FoxO，PTEN水平（P<0.05）。黃芪皂苷可有效改善環(huán)磷酰胺所造成的貧血，其機制可能與影響PI3K/Akt/mTOR信號通路相關基因有關。

[關鍵詞]黃芪； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； 化療貧血

[Abstract]To study the influence of astragaloside on mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR signal transduction in anemia model mice induced by chemotherapy， 48 male BALB/c mice which were 6-7 week old were picked as the research objects and randomly divided into four groups， blank group， model group， astragaloside group and astragaloside IV group. Each group was 12 mice. Chemotherapy anemia model was established by cyclophosphamide. The mice were drawn blood from eyeball after 14 days treatment. The QPCR was used to test the mRNA concentrations of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， FoxO， mTOR， PTEN in mouse spleen. In comparison of blank group， astragaloside group and astragaloside IV group，the erythrocyte counting and values of Hb in model group were significantly lower （P<0.05）. The volumes mRNA of Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR were lower in blank group， compared with other groups （P<0.05 or P<0.01）. The similar trend in astragaloside IV group except PI3K， comparing with blank group （P<0.05 or P<0.01）. The contents of these five genes were no significant differentiations between astragaloside group and blank group. The statistics were obvious between astragaloside group and astragaloside IV group （P<0.05 or P<0.01）. The concentrations of FoxO， PTEN were higher in model group，compared with blank group and astragaloside group （P<0.05 or P<0.01）， but no difference with astragaloside IV group. Comparing with blank group， the volumes of these two genes were increased in astragaloside IV group （P<0.05）， FoxO was higher in astragaloside group （P<0.05）， but PTEN was not significant. There was no the same as astragaloside group and Astragaloside IV group. Therefore， astragaloside could increase the contents of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， mTOR （P<0.01）， decrease the concentrations of FoxO， PTEN （P<0.05）. The changes in cyclophosphamide-induced anemia were highly significant by astragaloside. It could be related to the mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR Signal Transduction.

[Key words]astragaloside； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； chemotherapy-induced anemia

doi：10.4268/cjcmm20162019

黃芪是中醫(yī)臨床上常用的一味中藥，具有健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌等多種功效^[1-2]。其實早在《日華子本草》明確指出黃芪具有“補血”作用，《本草綱目》謂黃芪“可治一切氣衰血虛之癥”?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪的主要活性成分黃芪皂苷具有促進小鼠骨髓造血干細胞增殖的作用^[3-6]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt/mTOR）信號通路在維持造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和造血細胞定向分化中起著重要的作用，PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活或者失活都會破壞造血系統(tǒng)平衡，嚴重的影響造血機能^[7-8]。本文旨在探討PI3K/Akt/mTOR信號通路在黃芪皂苷對化療貧血模型小鼠發(fā)揮“補血”作用的機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠48只，雄性，6～7周齡，購自北京維通利華有限公司，許可證號SCXK（京） 2010-0002。

1.2 藥物與試劑 黃芪皂苷（astragaloside，成都曼斯特生物科技有限公司， 純度≥98%，批號MUST-13100901）；黃芪甲苷（中國食品藥品檢定研究院，批號110781-201314）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara公司）；Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies公司）。

1.3 儀器 HEMAVET950FS型全自動五分類多物種血液分析儀（美國Drew公司）；熒光定量PCR儀（Stratagene Mx3000P，德國安捷倫公司）；蛋白核酸分析儀（DU640，美國貝克曼公司）；低溫高速離心機（MR1822，法國Jouan SA公司）。

2 方法

2.1 造模與分組 48只雄性BALB/c小鼠，按外周血紅細胞計數(shù)隨機分為空白組、模型組、皂苷組、甲苷組，每組12只?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)，不予特殊處理。模型組、皂苷組和甲苷組分別于第1，3，5天按0.2 g·kg^-1體重劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。于造模第7天灌胃給藥，空白組、模型組均按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL蒸餾水；皂苷組按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL黃芪皂苷懸液；甲苷組按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL黃芪甲苷混懸液，連續(xù)灌胃14 d。于末次給藥后24 h，摘眼球取血，脫頸處死小鼠，立即解剖，摘取脾臟，去除其他脂肪組織，置于0.9%氯化鈉溶液中漂去血液，用濾紙吸干，并用錫紙包裹，放置-70 ℃ 冰箱冷凍保存。

2.2 外周血紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量的檢測 于末次給藥后24 h，摘眼球取血，置于抗凝管中，然后放置在渦旋混合機上，充分震蕩使血液與抗凝劑混勻，防止血液凝固，再用全自動五分類多物種血液分析儀檢測。

2.3 總RNA的提取和反轉錄 取50～100 mg脾組織，放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，反復3次后，加入1 mL Trizol，轉移入離心管中。將樣品室溫放置5 min，離心10 min，取上清，加入200 μL氯仿；加蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，離心15 min，使溶液分為3相；取無色上層水相400 μL，加入500 μL異丙醇；加蓋，上下顛倒10次混勻，室溫放置10 min后，離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1 mL，吹打洗滌沉淀，離心5 min；棄上清，空氣干燥至乙醇全部揮發(fā)；加入無RNA酶水30 μL溶解RNA，取4 μL RNA樣品稀釋25倍，使用核酸蛋白分析儀檢測吸光度，記錄A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀；計算RNA濃度。

使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。①基因組DNA的去除反應：0.5 μg總RNA加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，g DNA Eraser 1 μL，加無核酸酶水至10 μL；反應條件為42 ℃ 2 min。②反轉錄反應：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H₂O 4 μL加入步驟①的反應液10 μL；反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。產(chǎn)物cDNA 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物 應用Invitrogen公司在線引物設計軟件OligoPerpectTM Desiner設計，采用BLAST進行比對，由Invitrogen公司合成。設計的引物相關情況見表1。

2.5 QPCR檢測 mRNA表達的方法 總RNA提取采用Trizol方法，按試劑盒說明書操作，核酸蛋白分析儀檢測總RNA的A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀，計算濃度。cRNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒10 μL。在PCR反應體系中加入熒光染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后對未知模板進行相對定量分析。各基因實時定量PCR擴增產(chǎn)物的鑒定利用熔解曲線分析法：各基因完成PCR擴增循環(huán)后進行產(chǎn)物熔解曲線分析，以確定產(chǎn)物純度。熔解曲線收集條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min后采集熒光信號，重復40個循環(huán)；在循環(huán)反應后，按以下條件測溶解曲線：95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。在55 ℃升溫至95 ℃過程中，每升高0.5 ℃采集一次熒光信號。先以梯度稀釋的cDNA模板，測得各引物的擴增效率。再以各組樣品進行定量PCR檢測，反應結束后，由溶解曲線判斷PCR反應的特異性。

2.6 統(tǒng)計學方法 根據(jù)Ratio=（1+E_target）^{ΔCttarget（control-sample）}/（1+E_ref）^{ΔCtref（control-sample）}公式，計算出各樣品mRNA的相對表達量，其中E_target為目的基因的擴增效率，E_ref為內參基因的擴增效率，ΔCt為對照組Ct值與樣品Ct值的差。實驗數(shù)據(jù)用±s，用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計。組間比較用方差齊性檢驗，方差分析用One-Way ANOVA程序分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對化療貧血小鼠血紅細胞計數(shù)與血紅蛋白含量的影響 與空白組比較，模型組血紅細胞計數(shù)和血紅蛋白含量明顯降低（P<0.05），與模型組比較，皂苷組和甲苷組血紅細胞計數(shù)和血紅蛋白含量明顯升高（P<0.05），皂苷組的血紅細胞計數(shù)和血紅蛋白含量無明顯差異，見表2。

3.2 對化療貧血小鼠Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR mRNA水平的影響 與空白組、皂苷組、甲苷組相比，模型組Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷組這5種基因水平均較空白組無明顯差別；除PI3K外的4種基因，甲苷組較空白組有明顯差別（P<0.05或P<0.01）；而皂苷組與甲苷組水平也有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表3。

3.3 對化療貧血小鼠FoxO，PTEN mRNA水平的影響 模型組與空白組、皂苷組相比，F(xiàn)oxO，PTEN水平明顯升高（P<0.05或P<0.01），較甲苷組無明顯差異；甲苷組這2種基因水平均較空白組升高顯著（P<0.05）；而皂苷組的FoxO高于空白組（P<0.05），皂苷組的PTEN與空白組無明顯差異；皂苷組FoxO，PTEN水平與甲苷組無統(tǒng)計學意義，見表4。

4 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路參與許多重要生物學過程的調控，它在調節(jié)細胞生長和生存中起著關鍵性的作用。此通路中的關鍵節(jié)點包括PI3K，Akt，mTOR，PTEN，Bad，Bcl-xl，F(xiàn)oxO等。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信號通路的重要上游始動分子，關系著細胞生長、增殖和存活等許多方面，在造血干細胞的自我更新和分化中扮演著重要的角色。Akt是PI3K/Akt/mTOR信號通路中承上啟下的樞紐，激活的Akt能使底物的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化而起到抗凋亡和保護細胞的作用，調控B細胞的成熟和存活，抑制細胞凋亡。mTOR在細胞的生長和增殖中起著關鍵作用，mTORC1的異常激活會導致造血干細胞快速增殖并最終耗竭失去造血重建的能力。負調控蛋白 PTEN 缺失引起的PI3K異常激活會引起造血干細胞的耗竭和B細胞發(fā)育的阻滯。Bcl-xl是主要的抗凋亡分子，而Bad起著促進細胞凋亡的作用。兩者表達的平衡對細胞是否發(fā)生凋亡起著重要的調節(jié)作用。FoxO的缺失會導致造血干細胞造血重建失敗。PI3K/Akt/mTOR通路與干細胞的造血和免疫功能有關，廣泛參與了干細胞生長、增殖、凋亡等過程。因此，有效抑制PI3K信號通路能夠有效擴增造血干細胞，提高機體免疫，在開發(fā)造血系統(tǒng)疾病藥物方面有廣泛前景^[9-14]。

研究表明，模型組與空白組在Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR的mRNA水平存在明顯差異（P<0.01），說明模型組小鼠受到化療藥物環(huán)磷酰胺的影響，導致機體造血功能下降。空白組與皂苷組比較，在這5種基因水平上，無明顯差異，說明化療貧血小鼠經(jīng)黃芪皂苷后，其造血功能基本恢復。而空白組與甲苷組比較后發(fā)現(xiàn)，除PI3K外，其余基因甲苷組均較空白組有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），表明單純給予黃芪甲苷不能完全恢復這5種基因的水平。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，皂苷組與甲苷組在這5種基因水平上也存在明顯差異。有研究表明，黃芪皂苷中的化學成分除黃芪甲苷外，還存在黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，異黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及大豆皂苷Ⅰ等40多種皂苷類成分^[15]，分析可能是由于多種成分的相互作用，使得黃芪皂苷在改善機體造血功能，提高免疫方面強于單一成分黃芪甲苷。

本研究中，對于FoxO和PTEN 2個基因，空白組和模型組有顯著性差異（P<0.01），表明造模成功。皂苷組與模型組比較，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而甲苷組與模型組比較，無顯著性差異，表明皂苷組作用于化療貧血模型FoxO，PTEN的mRNA水平更強。空白組與甲苷組、皂苷組的對比，也說明這一特點?？瞻捉M與甲苷組有明顯差異（P<0.05），與皂苷組的FoxO有差異（P<0.05），但與皂苷組的PTEN無明顯差異。試分析黃芪皂苷在改善由于化療引起的造血功能異常方面作用優(yōu)于黃芪甲苷，除了黃芪皂苷多種成分的相互作用，還可能是黃芪皂苷的多種成分，更利于體內的吸收。因此，黃芪皂苷能夠作用于FoxO和PTEN 2個基因，改善化療貧血癥狀。

黃芪皂苷介導PI3K/Akt/mTOR信號通路，能夠改善化療藥引起的貧血癥狀，提高機體造血功能，從而增強免疫機能。同時本實驗還研究了PI3K/Akt/mTOR通路中與細胞凋亡有關的BCL-xl，bad基因，與造血干細胞造血重建有關的FoxO基因和與造血干細胞、B細胞發(fā)育有關的PTEN基因，表明黃芪皂苷影響造血干細胞的發(fā)育，重建和凋亡等過程，進而改善機體造血和免疫功能。因此，黃芪皂苷可以應用于腫瘤化療，在降低化療藥物的毒副作用具有重要意義，同時本研究也為中藥在治療腫瘤減毒增效方面，提供新思路。

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[責任編輯 馬超一]