楊先鋒 徐正偉 華玉偉 李季 戴雪梅 辛士超 黃天帶

摘 要 將分離自云南、海南兩地的9株橡膠樹紅根病菌，分別在面粉培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基及二者各一半混合而成的培養(yǎng)基（1/2 MS）上培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，其中7個菌株在1/2 MS上生長最佳，2個菌株在面粉培養(yǎng)基上生長最佳。同時，5個菌株在MS培養(yǎng)基上生長最慢，3個菌株在面粉培養(yǎng)基上生長最慢，一個菌株在1/2 MS培養(yǎng)基上生長較慢，這說明橡膠樹紅根病菌具有差異化的營養(yǎng)需求，而1/2 MS可以作為最有利于紅根病菌生長的培養(yǎng)基。另外，病原菌在3種培養(yǎng)基上具有不同的形態(tài)特征，而且在1/2 MS培養(yǎng)基上最早出現(xiàn)黃化色變。

關鍵詞 橡膠樹紅根病菌 ；培養(yǎng)基 ；營養(yǎng)需求 ；黃化變色

中圖分類號 S794.1 ；S763.7 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.04.014

Differential Nutrition Demand of Ganoderma pseudoferreum

YANG Xianfeng XU Zhengwei HUA Yuwei

LI Ji DAI Xuemei XIN Shichao HUANG Tiandai

（Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Rubber Biology，

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Nine Ganoderma pseudoferreum strains isolated from Yunnan and Hainan province were cultured on flour plate， MS plate and 1/2 MS plate（comprised by half flour and half MS） respectively. Then we found that seven strains grew best on 1/2 MS plate， the other two grew best on flour plate. Of the nine strains， there are five， three and one grew worst on MS， flour and 1/2 MS plate respectively，which indicate the differential nutrition demand of Ganoderma pseudoferreum. Moreover， the morphological character and yellow-changing of the strains were also affected by the different three cultures.

Keywords Ganoderma pseudoferreum ； culture ； nutrition demand ； yellowish-changing

伴隨著我國天然橡膠種植面積及種植年限的增加，以及老膠園的更新復種，橡膠樹根病的危害日趨嚴重[1]。在我國，橡膠樹根病是危害橡膠樹的重要病害之一，共有7種：紅根病、褐根病、紫根病、臭根病、黑根病、黑紋根病和白根病，其中又以橡膠樹紅根病危害面積最廣，危害程度最大[1-2]。發(fā)病樹若不進行及時處理，會嚴重減少膠樹的干膠產量，并最終導致膠樹死亡，嚴重縮短膠林的生產壽命。據(jù)估計，僅海南農墾每年因為橡膠樹紅、褐根病危害造成的干膠損失就高達3 000多t[3]。

橡膠樹紅根病病原菌為橡膠樹靈芝菌[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over.et Steinm]，屬擔子菌，層菌綱，靈芝屬[4]。相對于大多數(shù)可人工培養(yǎng)的植物病原真菌，橡膠樹紅根病菌在平板培養(yǎng)基上生長緩慢，速度不同步，且形狀不規(guī)則，屬于相對難培養(yǎng)的菌種，可能預示了病原菌生長營養(yǎng)需求的復雜性。課題組在前期的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，將分離自云南、海南兩大植膠區(qū)的9個紅根病菌株分別在3種培養(yǎng)基上生長，結果不同的菌株表現(xiàn)出了不同的培養(yǎng)基偏好性。除了生長速度的差別，不同的培養(yǎng)基還對菌絲的生長形態(tài)及顏色變化有影響。本研究的實施，將為篩選合適的紅根病菌培養(yǎng)基，探尋病原菌的生理代謝途徑，以及病害防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

橡膠樹紅根病菌株由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所涂敏博士提供（經真菌rDNA-ITS測序，與NCBI上橡膠樹紅根病菌ITS序列完全匹配）。其中菌株SD1、SD2、SD4分離自海南省儋州市三隊不同橡膠樹林段的病樹頭，A03、A05分離自海南省瓊中縣大豐農場的不同林段，B01、DF、YN1分離自云南省景洪市不同的橡膠樹農場，B04分離自云南省河口縣的壩灑農場。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 面粉培養(yǎng)基

面粉30 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，加去離子水定容至1 L，充分搖勻溶解后分裝三角瓶，121℃，21 min高溫高壓滅菌。

1.1.2.2 MS培養(yǎng)基

即為植物組織培養(yǎng)常用的誘導愈傷MS培養(yǎng)基稍加改良[5]。

1.1.2.3 1/2 MS培養(yǎng)基

將上述面粉培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基以1∶1的體積比混合而成。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

各菌株在面粉培養(yǎng)基平板上于28℃活化培養(yǎng)。在活化平板同一直徑圓周上取長勢一致的0.5 mm見方的小菌塊分別接種于3種培養(yǎng)基平板的正中央位置，每種培養(yǎng)基平板接3皿作為技術重復，然后于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)[6]，7 d后用十字交叉法[7]測量記錄菌落直徑（cm），繼續(xù)放置觀察記錄菌落的生長狀態(tài)并拍照。實驗進行3次生物學重復。

1.2.2 統(tǒng)計分析

每個技術重復的3個培養(yǎng)皿平板中菌落直徑的平均值，作為當次實驗每個菌株在相應培養(yǎng)基上生長速度的數(shù)值。最后，每個菌株在相應培養(yǎng)基平板上3次生物學重復的平均值，作為在相應培養(yǎng)基平板上生長速度的最終數(shù)值。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用軟件DPS完成。

2 結果與分析

2.1 不同菌株具有不同的培養(yǎng)基偏好性

如表1、圖1所示，在3種培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d后，不同的菌落大小顯示了各菌株對3種培養(yǎng)基的偏好性。

在全部9個菌株中，有7個菌株以1/2 MS為最適培養(yǎng)基（SD4，A03，A05，B01，DF，SD1，SD2）（圖2A）。在這7個菌株中，有2個菌株以MS為最差培養(yǎng)基（SD4，A03）（圖2A），有3個菌株以面粉為最差培養(yǎng)基（A05，B01，DF）（圖2B），另2個菌株SD1、SD2 在MS和面粉培養(yǎng)基上生長速度相當（圖2C）。

菌株YN1與B04在面粉培養(yǎng)基上生長速度最快（圖2D）。其中，相對于其它菌株，B04在全部3種培養(yǎng)基上都是生長速度最慢的菌株，而且是唯一在1/2 MS培養(yǎng)基上生長較慢的菌株。

2.2 3種培養(yǎng)基對紅根病菌的形態(tài)有影響

在各菌株長滿平皿后，9株紅根病菌在3種培養(yǎng)基上表現(xiàn)出了較一致的3種形態(tài)特征。雖然面粉培養(yǎng)基并不是大多數(shù)菌株生長最快的培養(yǎng)基，但菌株長滿培養(yǎng)皿后，菌絲生長最致密、旺盛，長長的氣生菌絲長滿皿的四周、皿蓋，甚至從皿縫中鉆出。而在MS培養(yǎng)基上，菌絲稀疏，形態(tài)顯得干癟，形狀呈車輪輻條輻射狀生長，長滿平皿后的菌絲量要少于面粉培養(yǎng)上的菌絲量。在1/2 MS培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)介于以上2種培養(yǎng)基之間（圖3）。

2.3 三種培養(yǎng)基對紅根病菌的黃化色變有影響

當紅根病菌長滿平皿并繼續(xù)培養(yǎng)4周以上時，已進入黃化，并進一步褐化、革質化的色變衰老期。但是，所有菌株都是在1/2 MS培養(yǎng)基上最早出現(xiàn)黃化變色。除了菌株A05和A03，其余菌株都是在MS培養(yǎng)基上最晚出現(xiàn)或最不易出現(xiàn)黃化色變（圖4）。

3 討論

病原菌的分離培養(yǎng)是病原菌后續(xù)諸多生物學研究的基礎。大多數(shù)可離體培養(yǎng)的植物病原真菌都可以在PDA培養(yǎng)基上很好地生長，但是橡膠樹紅根病菌屬于例外，在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢。以病菌的生長速度為標準，本實驗中的1/2 MS培養(yǎng)基對供試9株紅根病菌中的7株表現(xiàn)為最優(yōu)培養(yǎng)基。這種結果很容易理解，因為1/2 MS培養(yǎng)基綜合了面粉和MS兩種培養(yǎng)基的成分，營養(yǎng)更為全面。但是，YN1與B04兩個菌株卻以面粉培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基，特別是B04，在1/2 MS培養(yǎng)基上的生長速度，只相當于在面粉培養(yǎng)基上生長速度的53%。另外，在以1/2 MS培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基的7株菌株中，SD4、A03在MS培養(yǎng)基上生長最慢，A05、B01和DF在面粉培養(yǎng)基上生長最慢。在3次生物學重復之間，同一菌株，在相同的培養(yǎng)基平板上測量出的直徑大小可能不同，這是因為所用母本菌株的老化程度不同，對菌株的擴展速度有影響，但這不影響同一菌株在3種培養(yǎng)基上擴展快慢的趨勢。綜合以上結果，說明橡膠樹紅根病菌不同菌株間具有差異化的營養(yǎng)需求。

這種營養(yǎng)差異與地域無關。涂敏等[8]利用RAPD標記，對采集于云南和海南的18株橡膠樹紅根病菌進行遺傳相似性聚類分析，結果表明，不同生態(tài)類型地區(qū)的菌株存在較大的遺傳差異性，地理上隔離地區(qū)的病原菌各自具有相對獨立的進化途徑。彭軍等[9]利用rDNA-ITS序列對采集于云南和海南的12株橡膠樹紅根病菌進行了分子系統(tǒng)鑒定，結果表明，12個菌株可能由2個類群組成。本研究中，在1/2 MS上生長最佳的7個菌株中，B01和DF采集于云南，SD1，SD2，SD4及A03，A05采集于海南，而這其中，采集于海南的A05與采集于云南的B01和DF又表現(xiàn)為在面粉培養(yǎng)基上生長相對較慢。由此可以看出，本研究中9株菌株間的營養(yǎng)差異劃分跟地理區(qū)域來源并不相關。

植物病原真菌在不同培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不同是正?，F(xiàn)象[10]。肖仲久等[11]研究發(fā)現(xiàn)，4個不同來源地的白術白絹病菌雖然在6種培養(yǎng)基上生長存在一定差異，但統(tǒng)一地表現(xiàn)為在Czapek培養(yǎng)基上生長較差，在不同培養(yǎng)基上菌株LA20生長相對較差。但在本研究中，在面粉培養(yǎng)基上，A05生長速度最慢，只相當于在面粉培養(yǎng)基上生長速度最快的YN1生長速度的1/3；在1/2 MS培養(yǎng)基上，生長速度最慢的B04只相當于生長速度最快的A03的24.7%；A03、SD4和YN1在MS培養(yǎng)基上生長相對較慢，A05、B01和DF在面粉培養(yǎng)基上生長相對較慢，SD1和SD2在面粉和MS培養(yǎng)基上生長速度差不多，這充分說明了橡膠樹紅根病菌株間營養(yǎng)代謝的差異和多樣性。

紅根病菌在1/2 MS培養(yǎng)基上最早出現(xiàn)黃化變色，其原因或許不能簡單地歸結為1/2 MS培養(yǎng)基相對為最適培養(yǎng)基，病原菌在上面的生長速度最快，所以才最早進入衰老期。因為菌株YN1和B04是以面粉為最優(yōu)培養(yǎng)基，但2個菌株也是在1/2 MS培養(yǎng)基上最早出現(xiàn)黃化色變。而除了A05和A03，其余菌株都是在MS培養(yǎng)基上最晚出現(xiàn)或最不易出現(xiàn)黃化色變。由此推斷，面粉培養(yǎng)基含有病原菌黃化色變過程中所需的大部分營養(yǎng)成分，而MS培養(yǎng)基含有少部分與面粉培養(yǎng)基互補的營養(yǎng)成分。菌落擴展速度與菌落顏色變化并沒太大相關性，這與番茄早疫病菌不同[12]。當用平皿保存紅根病菌時，為了延緩黃化色變，延長保存期，建議用MS培養(yǎng)基來保存。

由實驗可知，在面粉培養(yǎng)基的基礎上加入MS培養(yǎng)基，無論是對紅根病菌的營養(yǎng)生長，還是對其形態(tài)及色變衰老都有重要的影響。說明MS培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分參與了紅根病菌多方面的基礎代謝。雖然本研究中的1/2 MS培養(yǎng)基可能還不是最適合橡膠樹紅根病菌的培養(yǎng)基，但是也為培養(yǎng)紅根病菌提供了一種不錯的培養(yǎng)基選擇。通過單因子實驗分析到底哪種營養(yǎng)元素參與了紅根病菌的相關生理代謝過程，進而鑒定對紅根病菌的生長有重要影響的營養(yǎng)成分及其參與的代謝通路，可以為通過化學藥劑甚至分子手段防治橡膠樹紅根病菌奠定基礎。

參考文獻

[1] 王樹明，張 勇，白朝良，等. 河口植膠區(qū)橡膠樹根病發(fā)生特點及綜合治理分析[J]. 熱帶農業(yè)科學，2014，34（2）：63-68.

[2] 白建相，王 涓，黃 林，等. 云南河口墾區(qū)橡膠樹根