趙兵，姚士強(qiáng)，郝小惠

（1.唐山市公安局法化大隊(duì)，河北唐山　063000；2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北唐山　063000）

溺死大鼠肺組織AQP-1、AQP-4的表達(dá)

趙兵1，姚士強(qiáng)1，郝小惠2

（1.唐山市公安局法化大隊(duì)，河北唐山063000；2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北唐山063000）

目的觀(guān)測(cè)生前溺死與死后拋入河水中大鼠肺組織水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）、AQP-4的表達(dá)變化。方法將30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為河水溺死組、拋尸入水組及脫頸致死組。HE染色觀(guān)察各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)、Western印跡法檢測(cè)其蛋白表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)法和Western印跡法檢測(cè)河水溺死組AQP-1蛋白的表達(dá)高于拋尸入水組和脫頸致死組（P〈0.05）。免疫組織化學(xué)法顯示河水溺死組AQP-4蛋白的表達(dá)高于拋尸入水組和脫頸致死組（P〈0.05），而Western印跡法未檢測(cè)出三者的差別（P＞0.05）。河水溺死組大鼠肺組織的AQP-1、AQP-4 mRNA表達(dá)高于拋尸入水組（P〈0.05）。結(jié)論河水溺死組的大鼠在急性肺損傷時(shí)肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA及蛋白表達(dá)增高可能對(duì)生前溺死與死后拋尸的鑒別有一定意義。

法醫(yī)病理學(xué)；溺水；水通道蛋白質(zhì)-1；水通道蛋白質(zhì)-4；大鼠

在溺死案例的法醫(yī)學(xué)鑒定中，由于水中尸體的個(gè)體差異及實(shí)際情況的復(fù)雜性，在法醫(yī)實(shí)踐中有時(shí)難以在尸體檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)特征性病理改變。雖然肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A［1］、組織硅藻檢測(cè)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段可提高對(duì)溺死鑒定的準(zhǔn)確性［2］，但溺死的鑒定仍然是法醫(yī)鑒定工作中的難點(diǎn)之一。尸體檢驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)相結(jié)合是目前提高溺死鑒定準(zhǔn)確率的有效途徑［3］，因此尋找和探索與溺死相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)可以為提高溺死鑒定的準(zhǔn)確率提供幫助。

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，目前認(rèn)為AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5等在肺毛細(xì)血管間的水轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用［4］，其中AQP-1、AQP-4在急性肺損傷的早期即可出現(xiàn)變化［5-6］，可望在生前溺死與死后拋尸入水的鑒別中發(fā)揮作用。本研究旨在探討河水中溺死大鼠肺組織AQP-1、AQP-4的表達(dá)變化，為溺死的鑒別提供一定的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量200～220g，購(gòu)自天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（津）2009-0001。

1.1.2試劑和儀器

取自唐山市陡河勝利橋段的河水。Trizol Reagent總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒和SYBRGreen qPCR反應(yīng)試劑盒（美國(guó)Promega公司），兔源性AQP-1多克隆抗體、兔源性AQP-4多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司），通用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)BioRAD公司），Rotor-Gene 3000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)QIAGEN公司），Image-pro plus 5.0圖像分析軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）。

1.2方法

安徽省傳統(tǒng)農(nóng)區(qū)宿州市埇橋區(qū)，過(guò)去農(nóng)民習(xí)慣于分散種養(yǎng)，難以抵御自然風(fēng)險(xiǎn)和市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)。2012年以來(lái)，埇橋區(qū)創(chuàng)建以“農(nóng)業(yè)企業(yè)為龍頭，家庭農(nóng)場(chǎng)為基礎(chǔ)，農(nóng)民合作社為紐帶”的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化聯(lián)合體，把單個(gè)的農(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)主體聯(lián)結(jié)成利益共同體和產(chǎn)業(yè)化鏈條，形成具有綜合競(jìng)爭(zhēng)力的“農(nóng)業(yè)航母”，在融合發(fā)展中取得“1+1+1＞3”的聚變效應(yīng)。

1.2.1動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分為河水溺死組、拋尸入水組和脫頸致死組，每組10只。

1.2.2模型的建立及取材

河水溺死組：在室溫23℃的條件下，將大鼠放入有機(jī)玻璃材料制成的有蓋水箱（50 cm×70 cm×60 cm）中，箱中放置河水，并使水位達(dá)到距離水箱頂部5cm處蓋上水箱蓋并開(kāi)始計(jì)時(shí)，至動(dòng)物溺死沉入箱底的時(shí)間作為動(dòng)物的溺死時(shí)間（平均13min）。

拋尸入水組：采用脫頸處死大鼠后，立即放入相同河水中浸泡13min。

脫頸致死組：作為對(duì)照，采取脫頸致死，但不投入水中。

所有大鼠均取右肺上葉做石蠟切片，左肺上葉肺組織置液氮中冷凍保存待用。

1.2.3 HE染色

大鼠肺組織經(jīng)固定、包埋后制成切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟、水化后，行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，觀(guān)察大鼠肺組織的病理學(xué)改變。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色

將組織切片行脫蠟、水化處理后，高壓修復(fù)抗原，用3%過(guò)氧化氫溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，血清封閉后各組切片分別加入兔源性AQP-1、AQP-4多克隆抗體（均為1∶100稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜后加入兔二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺蘭（digital audio broadcasting，DAB）顯色，光鏡下觀(guān)察。AQP-1、AQP-4的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色。應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片取3個(gè)高倍視野（400×），并測(cè)量每個(gè)視野中的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域細(xì)胞的光密度值，取3個(gè)高倍視野的平均光密度，代表該動(dòng)物肺組織AQP-1、AQP-4的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 Western印跡法檢測(cè)

每個(gè)樣本取50 mg冷凍保存的左肺上葉邊緣肺組織，提取蛋白后使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量總蛋白，各樣本取50 μg用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)印于醋酸纖維素膜上，分別用AQP-1、AQP-4多克隆抗體按1∶500稀釋后孵育，4℃過(guò)夜，用相應(yīng)的二抗稀釋后室溫孵育2h，ECL液顯影，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描圖像。內(nèi)參蛋白為β型肌動(dòng)蛋白（β-actin），分別將各組AQP-1、AQP-4和β-actin的條帶灰度比值進(jìn)行AQP-1、AQP-4的定量比較。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

取冷凍保存的左肺上葉肺組織40mg，用Trizol試劑盒提取總RNA并測(cè)定其濃度；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后應(yīng)用AQP-1、AQP-4的引物分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH）作為內(nèi)參照。各基因的引物片段序列如下，AQP-1：5′-ACCCGCAACTTCTCAA ACCAC-3′，3′-ACCCGCAACTTCTCAAACCAC-5′，擴(kuò)增片段141 bp；AQP-4：5′-GGCAGCAAGATAATGG ACCAC-3′，3′-CTACCTCAGAATACGCCCGTG-5′，擴(kuò)增片段143 bp；GAPDH：5′-GCAAGTTCAACGGCACA GTCA-3′，3′-CGCCAGTAGACTCCACGACATA-5′，擴(kuò)增片段141bp。采用二步法擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃15s，60℃20s，循環(huán)次數(shù)為40次。應(yīng)用ΔΔCt法對(duì)目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)量的分析比較，以脫頸致死組的AQP-1、AQP-4產(chǎn)物量為基準(zhǔn)，計(jì)算各組產(chǎn)物的相對(duì)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者均數(shù)間兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布者均數(shù)間兩兩比較采用Dunnett’s T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色可見(jiàn)，河水溺死組大鼠肺間隔增寬，肺泡壁毛細(xì)血管高度擴(kuò)張、充血，部分肺泡腔可見(jiàn)滲出液以及紅細(xì)胞，部分肺泡腔擴(kuò)張、肺泡壁斷裂呈肺氣腫表現(xiàn)；拋尸入水組大鼠肺泡壁毛細(xì)血管可見(jiàn)輕度擴(kuò)張，少量紅細(xì)胞滲出，少量肺泡融合形成大泡，少見(jiàn)肺泡腔溢出液；脫頸致死組未見(jiàn)明顯異常（圖1）。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

大鼠肺組織中AQP-1免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)主要位于肺間質(zhì)支氣管的上皮、細(xì)支氣管旁小血管內(nèi)皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮細(xì)胞（圖2）。各組AQP-1表達(dá)的平均光密度值見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，河水溺死組的AQP-1表達(dá)高于拋尸入水組和脫頸致死組（P〈0.05），拋尸入水組和脫頸致死組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

AQP-4陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于大小支氣管上皮、肺泡上皮細(xì)胞等部位（圖3）。各組大鼠AQP-4表達(dá)的平均光密度值見(jiàn)表1。結(jié)果表明，河水溺死組的AQP-4表達(dá)也高于拋尸入水組和脫頸致死組（P〈0.05），拋尸入水組和脫頸致死組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　大鼠肺組織AQP-1、AQP-4免疫組織化學(xué)表達(dá)的平均光密度值（n=10，±s）

表1　大鼠肺組織AQP-1、AQP-4免疫組織化學(xué)表達(dá)的平均光密度值（n=10，±s）

注：1）與脫頸致死組比較，P〈0.05；2）與拋尸入水組比較，P〈0.05

?

2.3 Western印跡法結(jié)果

AQP-1蛋白表達(dá)的Western印跡法檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)一致，即河水溺死組AQP-1蛋白的表達(dá)量與拋尸入水組和脫頸致死組相比表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），而拋尸入水組和脫頸致死組相比，AQP-1蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

對(duì)于A(yíng)QP-4而言，Western印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá)量在三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

河水溺死組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA的表達(dá)與拋尸入水組和脫頸處死組相比均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），而拋尸入水組和脫頸處死組AQP-1、AQP-4 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA的ΔΔCt值表達(dá)（n=10，±s）

表2　各組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA的ΔΔCt值表達(dá)（n=10，±s）

注：1）與脫頸致死組比較，P〈0.05；2）與拋尸入水組比較，P〈0.05

組別AQP-1 mRNAAQP-4 mRNA河水溺死2.547±0.5381）2）2.147±0.6391）2）拋尸入水1.175±0.3170.916±0.244脫頸致死1.000±0.0001.000±0.000

3　討論

1991年，Preston等［7］發(fā)現(xiàn)了位于紅細(xì)胞膜的疏水性跨膜蛋白質(zhì)即水通道蛋白（AQP），在哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)總共發(fā)現(xiàn)了13種亞型（AQP0～AQP12）。AQP表達(dá)于多種上皮、內(nèi)皮及其他組織上，能夠幫助水在不同滲透梯度間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，AQP還可介導(dǎo)甘油、乳酸、嘌呤等中小分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，AQP-0、1、2、4、5、6、8等主要介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在呼吸系統(tǒng)中，主要有AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5、AQP-8等表達(dá)在呼吸道和肺組織［10］。其中，AQP-1主要分布于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管周?chē)艽病夤莛つど掀?、淋巴管、胸膜和Ⅱ型肺泡上皮?xì)胞［11］；AQP-4主要分布于大小氣道上皮、肺泡內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、纖毛管及肺泡細(xì)胞的基底膜等處［4，12］。任何可引起肺損傷的因素均會(huì)導(dǎo)致上述指標(biāo)的變化，尤其在急性肺損傷時(shí)［13］。

溺死指水或液體進(jìn)入呼吸道，影響氣體交換而引起的死亡。在法醫(yī)學(xué)的死亡原因鑒定中，對(duì)于水中出現(xiàn)的尸體，首先需要鑒別的是生前溺死還是死后拋尸入水。溺水導(dǎo)致的水性肺氣腫以及多個(gè)器官硅藻的檢出是確定生前溺死的手段，但并不具備決定性的作用［14］。內(nèi)陸城市多見(jiàn)河水中溺死尸體，因此，本研究選用市內(nèi)河水利用大鼠制作溺死的模型，采用目前常用的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)模型肺組織的AQP-1、AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，河水溺死的大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA的表達(dá)均高于拋尸入水組2倍以上，且AQP-1蛋白表達(dá)增高，在Western印跡法和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中都得到了相同的結(jié)果；而AQP-4蛋白在免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，河水溺死組陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物高于拋尸入水組，但Western印跡法檢測(cè)結(jié)果提示兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示，溺液短時(shí)間迅速進(jìn)入大鼠呼吸道，使局部水分迅速增多，影響肺部氣體交換，導(dǎo)致肺部急性損傷，呼吸上皮等組織細(xì)胞缺氧水腫，肺內(nèi)水的平衡被破壞、轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，而AQP作為維持水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白，應(yīng)激性迅速生成增多以彌補(bǔ)水轉(zhuǎn)運(yùn)能力的不足。因此短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)AQP-1、AQP-4在mRNA水平的增高。而拋尸入水的大鼠不會(huì)引起肺組織的AQP-1、AQP-4 mRNA的變化。同時(shí)，由于真核細(xì)胞核膜的存在，使得真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯在不同的部位進(jìn)行，蛋白的合成往往滯后于mRNA的變化。溺死往往發(fā)生在短時(shí)間內(nèi)，因此本實(shí)驗(yàn)中AQP mRNA的變化相對(duì)明顯。

本實(shí)驗(yàn)在A(yíng)QP-4蛋白的檢測(cè)中出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)和Western檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，分析原因可能由于A(yíng)QP-4蛋白主要表達(dá)于大小氣道上皮、肺泡內(nèi)皮細(xì)胞等，免疫組織化學(xué)的結(jié)果也顯示陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域在大小氣道上皮更明顯，在進(jìn)行定量分析時(shí)大小氣道的陽(yáng)性表達(dá)更占優(yōu)勢(shì)，而Western印跡法選取肺邊緣組織進(jìn)行研磨提取肺組織總蛋白檢測(cè)，由于短時(shí)間內(nèi)溺亡組大鼠肺組織中AQP-4蛋白增加幅度較小，所以在總蛋白中比較其成分的變化不明顯。AQP-1在微血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管周?chē)艽病夤莛つど掀?、淋巴管等表達(dá)，定位廣泛，含量相對(duì)較高，可能在病理情況下較其他類(lèi)型的AQP發(fā)生變化更早，所以其在較短時(shí)間內(nèi)的蛋白水平的微弱表達(dá)變化更容易捕捉到。AQP-4在蛋白水平的變化，也有待選擇不同溺液、觀(guān)察不同實(shí)驗(yàn)條件等來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)于A(yíng)QP與溺死的研究較少，每個(gè)研究的溺液成分和具體實(shí)驗(yàn)條件也不盡相同，故所得結(jié)果也有差異。在法醫(yī)學(xué)死因鑒定的實(shí)際案例中，往往案情復(fù)雜、混雜因素多樣、尸體的狀況相對(duì)復(fù)雜，需要考慮的因素眾多，不能簡(jiǎn)單依靠某一個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。本研究只是初步探討了一定條件下建立的大鼠溺水動(dòng)物模型的AQP-1、AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)變化，只應(yīng)用了當(dāng)?shù)氐暮铀@一種成分作為溺液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是基于溺亡之后立即留取的較新鮮的組織，在眾多的實(shí)際溺亡案件中，尸體在水中的狀態(tài)往往更加復(fù)雜。在不同性質(zhì)的溺液中上述結(jié)果是否一致，在溺死的人類(lèi)標(biāo)本中是否能得到同樣的結(jié)論，還需設(shè)計(jì)更貼合實(shí)際情況的溺水模型進(jìn)一步研究。另外，溺亡時(shí)除肺之外的其他組織器官中AQP表達(dá)情況也值得關(guān)注。還可以結(jié)合硅藻檢測(cè)以及肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A等指標(biāo)探索和明確AQP家族在溺亡案件中的鑒定價(jià)值和意義，給溺亡案件的鑒定提供更多線(xiàn)索和幫助。

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（本文編輯：黃平）

Expression of AQP-1 and AQP-4 in the Lungs of Drown Rats

ZHAO Bing1，YAO Shi-qiang1，HAO Xiao-hui2
（1.Forensic Science Brigade of Tangshan Public Security Bureau，Tangshan 063000，China；2.Medical Research Center，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

Objective To observe the changes of expression of aquaporin-1（AQP-1）and AQP-4 in drowned and postmortem immersed rats’lungs.Methods Thirty healthy male Wistar rats were randomly divided into drowning group，postmortem immersion group and cervical dislocation group.The morphological changes of rats’lungs were observed using HE staining.The mRNA and protein expressions of AQP-1 and AQP-4 in rats’lungs were detected by real-time PCR，immunohistochemistry and Western blotting，respectively.Results The results of immunohistochemistry and the Western blotting showed that the protein expression of AQP-1 of the drowning group was higher than the postmortem immersion group and the cervical dislocation group（P＜0.05）.The result of immunohistochemistry showed that the protein expression of AQP-4 of the drowning group was higher than the postmortem immersion group and the cervical dislocation group（P＜0.05）while no difference were detected among the three of them by Western blotting（P＞0.05）.The mRNA expressions of AQP-1 and AQP-4 in rats’lungs of the drowning group was significantly higher than the postmortem immersion group（P＜0.05）.Conclusion The increase of mRNA and protein expressions of AQP-1 and AQP-4 in lungs of rats with cute lung injury of the drowning group would be useful for differentiating vital drowning from postmortem immersion.

forensic pathology；drowning；aquaporin-1；aquaporin-4；rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.001

1004-5619（2016）05-0321-05

河北省科技廳科技支撐項(xiàng)目（10276116D）

趙兵（1971—），男，主要從事法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)和法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：bingzhao_2012@163.com

郝小惠，女，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的研究；E-mail：haoxiaohui2005@163.com

（2014-08-27）