沈洪辰　丁吉勇　李　麗　劉夫鋒,3,*

(1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津300072；2天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457；3天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

Y220C突變體影響p53C蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子動力學(xué)模擬

沈洪辰1丁吉勇1李麗2劉夫鋒1,3,*

(1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津300072；2天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457；3天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

p53是迄今發(fā)現(xiàn)突變頻率最高的一種腫瘤抑制蛋白質(zhì)，突變會導(dǎo)致p53抑癌功能喪失并誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。絕大多數(shù)的突變發(fā)生在p53的核心DNA結(jié)合區(qū)域(p53C)，其中Y220C是研究較多的一種突變體。雖然已有研究表明該突變能夠降低p53C的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但其影響p53C構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機制尚不清晰。本文利用分子動力學(xué)(MD)模擬方法研究了p53C突變體Y220C(p53C-Y220C)的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)Y220C突變主要影響Y220C cluster區(qū)域(包括殘基138－164和215－238)，且Y220C突變減少了Y220C cluster的β-折疊含量。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Y220C突變不僅直接破壞突變氨基酸與周圍氨基酸Leu145和Thr155之間的氫鍵，而且降低了Y220C cluster區(qū)域的折疊片S3和S8之間的氫鍵數(shù)量，使Y220C突變所形成的親水性空腔變大，加速了水分子進(jìn)入該蛋白質(zhì)內(nèi)部，并最終導(dǎo)致了p53C-Y220C變性。MD模擬結(jié)果揭示了Y220C突變影響p53C結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的分子機制，該研究對p53C-Y220C突變體高效穩(wěn)定劑的篩選和設(shè)計具有重要意義。

癌癥；p53；殘基突變；構(gòu)象轉(zhuǎn)換；分子動力學(xué)模擬

1　引言

p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白質(zhì)。p53通過與DNA或其他蛋白質(zhì)(如MDM2等1)發(fā)生相互作用從而在細(xì)胞生長周期的調(diào)控、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮著重要的作用2。因此p53具有阻滯腫瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等多種抑癌功能。人類p53蛋白質(zhì)含有393個氨基酸殘基，其中94－292位氨基酸為該蛋白質(zhì)的核心結(jié)構(gòu)域，被定義為p53C3。據(jù)統(tǒng)計，約50%的人類癌癥是由p53的殘基突變引起的，其中90%以上的突變發(fā)生在p53C區(qū)域4。p53C的突變種類眾多，基于尿素變性的折疊-去折疊平衡實驗和低溫條件下的DNA結(jié)合實驗結(jié)果，Bullock等5將常見的p53突變體分成以下四類：DNA接觸類(如R273H等)，DNA結(jié)合區(qū)域(如R282W，G245S和R249S等)，鋅離子結(jié)合區(qū)域(如M237I，R175H和C242S等)和β-三明治區(qū)域(如V157F，F(xiàn)270C和Y220C等)。在最易引發(fā)癌癥的p53突變中，Y220C突變排在第9位。另據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，由Y220C突變體所引發(fā)的癌癥病例每年約7.5萬。隨著世界癌癥發(fā)病率的增加，預(yù)計到2020年每年由Y220C突變所引發(fā)的病例將增加至每年10萬以上6。圖1所示為p53C-Y220C突變體的三維結(jié)構(gòu)。從圖1a可以看出，p53C包含10個β-折疊片(S1－S10)、5個環(huán)(L1－L3，S3/S4和S7/S8 loop)和2個螺旋結(jié)構(gòu)(H1－H2)。位于S3/S4環(huán)和S7/ S8環(huán)之間的220位酪氨酸突變成半胱氨酸會在p53C表面形成一個空腔，如圖1b所示。更重要的是Y220C突變會大大降低p53C的熱穩(wěn)定性(約16.75 kJ·mol－1)。但Y220C突變所引起的p53CY220C構(gòu)象轉(zhuǎn)換的作用機制尚不清晰，這嚴(yán)重影響了Y220C突變體穩(wěn)定劑的虛擬篩選和設(shè)計。

由于蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換非常迅速，利用目前的實驗技術(shù)很難從原子和分子角度檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致Y220C突變所引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)換至今仍然無法用現(xiàn)有的實驗方法進(jìn)行研究。然而分子動力學(xué)(MD)模擬方法的出現(xiàn)彌補了現(xiàn)有實驗研究的不足，并已廣泛用于蛋白質(zhì)折疊7、去折疊8和聚集9等領(lǐng)域的研究中。MD模擬方法也已用于p53構(gòu)象轉(zhuǎn)換的相關(guān)研究10。例如，Espinoza-Fonseca等11利用MD模擬方法研究了p53蛋白質(zhì)N-末端的F19－L22螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Calhoun和Daggett12利用MD模擬研究了L145Q、V157F和R282W突變對p53C結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)L145Q和V157F會破壞β-折疊片的結(jié)構(gòu)和環(huán)-折疊-螺旋模式，而R282W突變會使環(huán)-折疊-螺旋模式扭曲。且這些突變體均會使DNA結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)重排，從而影響p53結(jié)合DNA的活性，并最終降低了p53的抑癌功能。許朝瑩等13利用全原子MD模擬研究了常見的3個殘基突變R249S、R248W和G245S對p53的DNA結(jié)合域肽段230－258的結(jié)構(gòu)影響。上述研究的突變體主要集中于DNA結(jié)合區(qū)域。與之相反，Y220C突變正好遠(yuǎn)離DNA結(jié)合區(qū)域。雖然已有研究結(jié)果表明Y220C突變能夠降低該蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并開發(fā)了多種能夠穩(wěn)定該突變體的穩(wěn)定劑分子，如他克林14、PhiKan08315和PK51744等。但該突變影響p53C構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機制尚不清晰，這嚴(yán)重阻礙了該突變體高效穩(wěn)定劑的開發(fā)。因此利用MD模擬來研究Y220C突變所引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機制對于進(jìn)一步理性設(shè)計p53CY220C突變體的穩(wěn)定劑具有非常重要的理論指導(dǎo)作用。

圖1　p53C突變體Y220C的三維結(jié)構(gòu)Fig.1　3D structure of p53C-Y220C

本研究利用全原子MD模擬方法研究了p53CY220C的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。首先分析了Y220C突變對其周圍區(qū)域結(jié)構(gòu)的影響，并確定了Y220C突變所影響的結(jié)構(gòu)區(qū)域；然后分析了Y220C突變對該區(qū)域二級結(jié)構(gòu)和氫鍵作用力的影響；最后研究了Y220C突變對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響。該研究不僅解釋了Y220C突變影響p53C構(gòu)象轉(zhuǎn)換的作用機理，而且為Y220C突變體穩(wěn)定劑的設(shè)計和篩選奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

2　實驗部分

2.1模擬體系

蛋白質(zhì)p53C-Y220C的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)獲得(http://www.rcsb.org/pdb/home/ home.do)，它的PDB ID為2J1X16。本研究選取了該晶體結(jié)構(gòu)中的B鏈作為p53C-Y220C的初始模擬結(jié)構(gòu)?？紤]到野生型p53C蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較差，從不同的溶液條件下獲得的p53C的結(jié)構(gòu)均有較大的差異。因此，選擇不同實驗條件下野生型p53C的結(jié)構(gòu)作為野生型對照，可能會給后續(xù)分析引入較大的誤差。因此，本研究在突變體p53C-Y220C結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上利用SYBYL 6.92軟件將220位殘基半胱氨酸突變成酪氨酸，然后利用全原子MD模擬優(yōu)化后的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作為野生型p53C的初始結(jié)構(gòu)。并以此為對照，以期從原子和分子角度解析Y220C突變對p53C結(jié)構(gòu)造成的影響。

2.2分子動力學(xué)模擬

所用MD模擬均采用GROMACS 4.5軟件進(jìn)行17，水分子采用SPC模型18。首先將p53C-Y220C置于一個邊長為8 nm的立方體盒子中心，并使蛋白質(zhì)的每個原子與盒子之間的距離均大于1.0 nm。向盒子中隨機加滿水分子，并用5個Cl－離子替代5個水分子以使模擬體系為電中性。隨后用兩次1000步的能量最小化模擬優(yōu)化該體系：首先固定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不變，僅讓水分子的結(jié)構(gòu)和位置變化，隨后使所有的分子都可以自由運動；然后利用限制性MD模擬分別在正則和等溫等壓系綜下平衡該體系；這兩步MD模擬的主要目的是優(yōu)化目標(biāo)蛋白質(zhì)與溶劑和Cl－之間的相互作用，從而使該模擬體系達(dá)到最優(yōu)值。最后將完全優(yōu)化好的體系進(jìn)行MD模擬。

本研究采用經(jīng)典的Gromos96 53a6力場研究p53C-Y220C的構(gòu)象轉(zhuǎn)換19，采用Verlet蛙跳算法求解牛頓運動方程，積分步長設(shè)為2 fs。計算過程中利用Lennard-Jones函數(shù)計算范德華作用力，非鍵截斷距離設(shè)為1.4 nm；用LINCS算法約束所有原子的鍵長20，利用particle mesh Ewald(PME)方法計算長程靜電相互作用21，格點寬度設(shè)為0.12 nm。模擬過程中采用周期性邊界條件。所有MD模擬均在等溫等壓系綜下進(jìn)行，溫度為310 K，壓力為1大氣壓，分別通過V-rescale22和Parrinello-Rahman23方法控制溫度和壓力，溫度和壓力耦合常數(shù)分別為0.1和0.5 ps。MD模擬共做三次平行實驗，每次模擬時間為100 ns。所有MD模擬計算均在曙光TC2600刀片服務(wù)器(每刀片包括4路4核的AMD Opteron 8347HE CPU和8G內(nèi)存)上完成(Dawning, Tianjin,China)。

2.3數(shù)據(jù)分析方法

p53C及其突變體中Cα原子的均方根偏差(Cα-RMSD)和均方根漲落(RMSF)以及整個蛋白質(zhì)的溶劑可及表面積(SASA)由GROMACS軟件自帶的g_rms、g_rmsf和g_sas程序分別計算。采用DSSP軟件分析p53C及其突變體在模擬過程中的二級結(jié)構(gòu)變化，該過程使用GROMACS軟件自帶的do_dssp程序計算。蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵數(shù)量利用GROMACS軟件自帶的g_hbond程序計算。氫供體和受體之間的距離截斷值設(shè)定為0.35 nm，受體-供體-氫原子之間的角度截斷值設(shè)定為30°。本文所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的典型構(gòu)象均使用視覺分子動力學(xué)(VMD)軟件繪制(http://www.ks.uiuc.edu/Research/ vmd/)24。

3　結(jié)果與討論

3.1Y220C突變對蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

為了研究Y220C突變對p53C蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，首先計算了野生型p53C及其突變體p53C-Y220C的Cα-RMSD在100 ns模擬時間內(nèi)的變化，結(jié)果如圖2所示。RMSD數(shù)值常被用來表征模擬過程中某時刻的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)之間的差異。RMSD值越大，說明此模擬時刻蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)之間的偏差越大。因此，蛋白質(zhì)的Cα-RMSD值是衡量模擬過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換的重要依據(jù)。從圖2可以看出，野生型p53C的Cα-RMSD數(shù)值在10 ns內(nèi)急劇上升到0.3 nm，并經(jīng)過緩慢的上升，在最后20 ns內(nèi)趨于穩(wěn)定。而p53CY220C的Cα-RMSD數(shù)值的變化趨勢與野生型的基本一致。在10－45 ns內(nèi)，p53C-Y220C的Cα-RMSD數(shù)值比野生型的還要小，僅在最后50 ns內(nèi)突變體的Cα-RMSD數(shù)值比野生型的稍大(圖2)。因此，僅采用Cα-RMSD的數(shù)值很難得出p53C的穩(wěn)定性高于突變體p53C-Y220C的結(jié)論，這與實驗結(jié)果是不一致的。大量的研究結(jié)果表明，Y220C會使p53C的穩(wěn)定性大大降低16。究其原因，主要是野生型p53C的結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定，這導(dǎo)致在MD模擬過程中野生型的結(jié)構(gòu)變化也較大，從而利用整個蛋白質(zhì)的Cα-RMSD數(shù)值并不能準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

圖2　p53C和p53C-Y220C的Cα原子均方根偏差隨模擬時間的變化Fig.2　Root-mean-square deviations(RMSD)for Cαatoms of p53C and p53-Y220C as a function of time for the simulations

從前面的分析可知，利用整個蛋白質(zhì)Cα-RMSD值很難表征野生型p53C和Y220C突變體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此推測該突變可能僅影響該蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)區(qū)域。為了進(jìn)一步確定Y220C突變所影響的區(qū)域，本研究計算了整個蛋白質(zhì)Cα-RMSF值。該數(shù)值的大小代表蛋白質(zhì)中Cα原子在模擬過程中構(gòu)象變化的程度。Cα原子的RMSF數(shù)值大表示該原子在模擬過程中的構(gòu)象變化較大；與之相反，則表示該原子所屬結(jié)構(gòu)在模擬過程中比較穩(wěn)定。圖3所示為兩種蛋白質(zhì)的Cα-RMSF數(shù)值。從圖3可以看出，p53C-Y220C的S7和S8區(qū)域(分別對應(yīng)殘基215－220和233－238)的Cα-RMSF數(shù)值變化較大，明顯高于野生型p53C。從圖1可以看出S7和S8區(qū)域都臨近突變點，因此可以推測這些結(jié)構(gòu)變化均是由于Y220C突變所導(dǎo)致的。另外，從圖1a可以看出殘基Y220主要處于S3/S4環(huán)與S7/S8環(huán)之間。因此，本研究將S3、S4、S7、S8以及連接這4個β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)(S3/S4環(huán)和S7/S8環(huán))定義為Y220C cluster，該結(jié)構(gòu)域包括138－164和215－238位氨基酸殘基。雖然H1/S5之間和S8/S9之間環(huán)結(jié)構(gòu)的Cα-RMSF數(shù)值的變化也比較大，但這可能是因為這部分結(jié)構(gòu)是無規(guī)卷曲，對結(jié)構(gòu)變化更敏感從而導(dǎo)致該區(qū)域的Cα-RMSF數(shù)值發(fā)生較大改變的緣故，因此在后期的研究中不予考慮!

圖3　分子動力學(xué)模擬過程中p53C和p53C-Y220C的Cα原子的均方根漲落Fig.3　Root mean square fluctuation(RMSF)for Cαatom per residue for p53C and p53C-Y220C during the MD simulations

圖4　p53C及其突變體Y220C中Y220C cluster的Cα原子的均方根偏差的數(shù)值隨模擬時間的變化Fig.4　RMSD for Cαatom of Y220C cluster of p53C and p53C-Y220C as a function of time for the simulations

圖4為野生型p53C及其Y220C突變體的Y220C cluster的Cα-RMSD數(shù)值隨模擬時間的變化。從圖4可以看出，在10 ns內(nèi)野生型p53C和Y220C突變體中Y220C cluster的Cα-RMSD的增長趨勢和大小基本相同。但在隨后的90 ns內(nèi)p53CY220C的Cα-RMSD數(shù)值均比野生型p53C高。這說明Y220C突變主要影響了Y220C cluster區(qū)域的穩(wěn)定性，而對蛋白質(zhì)其它結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響較小。因此，在下面分析中僅考慮了Y220C突變對Y220C cluster區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)、氫鍵和蛋白質(zhì)表面疏水性的影響。

3.2Y220C突變對Y220C cluster區(qū)域二級結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步研究Y220C突變對Y220C cluster構(gòu)象的影響，首先利用GROMACS軟件中自帶的do_dssp程序分析了Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖5和表1所示。圖5a所示為野生型p53C的Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化。從圖5a可以看出，Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)在100 ns內(nèi)的模擬中變化很小，其中S3、S4、S7和S8均保持為初始的β-折疊結(jié)構(gòu)，基本沒有變化。Y220C cluster的β-折疊含量在100 ns模擬后為42.9%，稍高于初始的40.8%(表1)。只有S3/S4和S7/S8連接部分的二級結(jié)構(gòu)在模擬過程中發(fā)生了輕微的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換(圖5a)。圖5b所示為p53C-Y220C突變體的Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化。如圖5b所示，當(dāng)Tyr突變成Cys后，突變體中一些β-折疊結(jié)構(gòu)遭到破壞，如S3、S4、S7和S8的β-折疊結(jié)構(gòu)的含量隨著模擬時間的延長逐漸降低。從表1可以看出，突變體p53C-Y220C中Y220C cluster的β-折疊含量從最初的40.8%降低到100 ns后的32.7%，而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)則從初始的42.9%增加到49%。因此，Y220C突變會破壞Y220C cluster中的β-折疊結(jié)構(gòu)。眾所周知，β-折疊是組成β-三明治的最主要結(jié)構(gòu)，β-折疊的破壞是整個p53C構(gòu)象轉(zhuǎn)換的主要步驟之一。

圖5　p53C(a)和p53C-Y220C(b)中Y220C cluster二級結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化Fig.5　Secondary structure of Y220C cluster as a function of simulation time for p53C(a)and p53C-Y220C(b)

表1　p53和突變體p53-Y220C中Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)含量Table 1　Content of secondary structures of Y220C cluster in p53C and p53C-Y220C

3.3Y220C突變對Y220C cluster區(qū)域中氫鍵作用力的影響

從前面的二級結(jié)構(gòu)分析可以看出，Y220C cluster的二級結(jié)構(gòu)主要是β-折疊片層結(jié)構(gòu)。前期研究表明，氫鍵是β-折疊結(jié)構(gòu)中主要的作用力之一，它在β-折疊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定過程中發(fā)揮了重要作用。此外，野生型p53C中的220位酪氨酸殘基含有一個酚羥基，它可以和周圍的基團(tuán)形成氫鍵。而突變后的半胱氨酸殘基的側(cè)鏈僅含有一個亞甲基和一個巰基，這些基團(tuán)均不能形成氫鍵作用。圖6為100 ns模擬時間內(nèi)野生型p53C的220位殘基突變前后與其它殘基之間形成的氫鍵隨模擬時間的變化。從圖6可以看出野生型p53C的Tyr220可以與附近的6個氨基酸殘基形成10個不同的氫鍵。如圖6a所示，Tyr220－Leu145和Tyr220－Thr155之間形成的兩個氫鍵穩(wěn)定性均較高，在模擬過程中90%以上的時間內(nèi)均能夠形成氫鍵。另外，Tyr220－Thr230在34%模擬時間內(nèi)能夠形成氫鍵。而另外7個氫鍵的穩(wěn)定性均較差。殘基Leu145和Thr155分別位于S3和S4上，因此這兩個氫鍵可以使S7/S8環(huán)和S3/S4環(huán)之間發(fā)生較強的相互作用。從圖7a可以看出Tyr220殘基正好位于S3和S4之間，Tyr220能夠和Thr155和Leu145分別形成1個氫鍵從而穩(wěn)定S3和S4的二級結(jié)構(gòu)。因此，Tyr220對整個Y220C cluster的穩(wěn)定性有非常重要的作用。當(dāng)Tyr220突變成Cys后，該殘基僅能與周圍的殘基形成4個氫鍵(圖7b)，遠(yuǎn)小于Tyr220與周圍殘基形成的10個氫鍵(圖7a)。從圖7b可以看出Cys220僅能與Thr155形成1個穩(wěn)定的氫鍵。由于Tyr220突變成Cys后，極大降低了該殘基與Y220C cluster周圍殘基之間的氫鍵作用力，從而使Y220C cluster的穩(wěn)定性急劇下降。

圖6　野生型p53C(a)和p53C-Y220C(b)中220位氨基酸殘基在模擬100 ns內(nèi)形成的氫鍵Fig.6　Hydrogen bonds interaction of Tyr220 with surrounding residues in p53C(a)and Cys220 with surrounding residues in p53C-Y220C(b)in the 100 ns MD simulations

圖7　(a)p53C的Tyr220和(b)p53C-Y220C的Cys220氨基酸和它們周圍氨基酸之間的氫鍵分析Fig.7　Hydrogen bond analyses of Tyr220 with surrounding residues in p53C(a)and Cys220 with surrounding residues in p53C-Y220C(b)

從上面的分析可以得出，由于Y220C突變使S7/S8環(huán)穩(wěn)定性降低，所以當(dāng)S7/S8環(huán)位置發(fā)生變化時也會影響與之連接的S8結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致與S8相鄰的S3之間的氫鍵作用遭到部分破壞。圖8所示為100 ns內(nèi)S3與S8之間形成的氫鍵數(shù)量隨模擬時間的變化。從圖8可以看出，野生型p53C中S3與S8在60－100 ns之間均有氫鍵，形成的氫鍵數(shù)量一直在4－8左右波動。然而，在Y220C突變體中S3與S8形成的氫鍵數(shù)隨著時間的變化呈現(xiàn)下降趨勢，在最后的40 ns內(nèi)形成的氫鍵數(shù)量在2－5之間波動。圖9為100 ns時p53C和p53C-Y220C中S3與S8形成氫鍵的典型構(gòu)象。從圖9a可以看出，野生型p53C中S3與S8之間形成7個氫鍵，主要是S3和S8中的主鏈氨基上的氫原子供給羧基上的氧原子而形成的氫鍵，這是β-折疊結(jié)構(gòu)中最為常見的氫鍵形式25。當(dāng)220位殘基Y突變成C后，Y220C突變體的S3與S8之間的氫鍵數(shù)僅剩下中間的4個，而N235與L139、T230與L145之間的3個氫鍵在模擬過程中消失(圖9)，從而破壞了S3與S8之間的氫鍵作用力并降低了Y220C cluster的β-折疊的含量(表1)。上述結(jié)果說明了S7/S8環(huán)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定會進(jìn)一步影響與之相連的區(qū)域，這也證明了Y220C突變會使Y220C cluster整個結(jié)構(gòu)受到破壞。在其它導(dǎo)致p53C穩(wěn)定性降低的突變體中，也存在這種β-折疊片層之間氫鍵遭到破壞的現(xiàn)象，如L145Q和V157F12。由于β-三明治結(jié)構(gòu)是p53C的骨架結(jié)構(gòu)，所以這種破壞是導(dǎo)致p53-Y220C不穩(wěn)定的重要因素之一。

圖8　野生型p53C和p53C-Y220C突變體中的S3與S8形成氫鍵個數(shù)隨時間變化Fig.8　Numbers of H-bonds between S3 and S8 of p53C and p53C-Y220C as functions of simulation time

圖9　模擬100 ns過程中p53C(a)和p53C-Y220C(b)中的S3與S8的主鏈之間的氫鍵示意圖Fig.9　Scheme of hydrogen bonds between backbones of S3 and S8 for p53C and p53C-Y220C during the 100 ns MD simulation

3.4Y220C突變對蛋白表面疏水性的影響

野生型p53C的Tyr220殘基的苯環(huán)位于蛋白質(zhì)的疏水表面，而突變后的Cys是一個親水型殘基，且Cys的體積比Tyr的要小，因此Y220C突變會在蛋白質(zhì)表面形成一個親水空腔。為了進(jìn)一步分析Y220C突變對蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的影響，我們又計算了Y220C cluster的溶劑可及表面積。SASA是指使用半徑為0.14 nm的溶劑分子在蛋白質(zhì)的范德華表面滾動時其球心所經(jīng)過的曲面面積。蛋白質(zhì)在折疊過程中疏水基團(tuán)傾向于遠(yuǎn)離溶劑而埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此通過對蛋白質(zhì)的疏水性和親水性SASA的計算可以獲得蛋白質(zhì)表面水分子的分布情況。若親水性可及表面積隨著模擬時間的增加而增加就表示蛋白質(zhì)表面的親水性空腔面積增加而更使空腔中的水分子的數(shù)量增加。否則，就表示蛋白質(zhì)將空腔中的水分子外排而發(fā)生了塌縮。從圖10可以看出，在模擬100 ns內(nèi)，p53C-Y220C的Y220C cluster的親水區(qū)域SASA要高于野生型p53C，疏水區(qū)域的SASA則恰好相反。位于p53C表面的Tyr220殘基上的苯環(huán)基團(tuán)是疏水的，其可以阻止水分子進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部；而當(dāng)Tyr220突變成Cys后，Y220C cluster的親水SASA大于野生型的。因此由于Y220C突變在蛋白表面形成的親水性空腔容易結(jié)合水分子，使水分子能夠進(jìn)入突變所形成的親水空腔內(nèi)部。而且Y220C突變降低了Y220C cluster之內(nèi)的氫鍵，從而使整個蛋白結(jié)構(gòu)變的松散，暴露出了更多內(nèi)部的親水基團(tuán)。最終導(dǎo)致p53C-Y220C構(gòu)象轉(zhuǎn)換和變性。

圖10　p53C和p53C-Y220C中Y220C cluster在模擬100 ns內(nèi)親水和疏水SASA隨模擬時間的變化Fig.10　Values of hydrophilic and hydrophobic solvent accessible surface area(SASA)of Y220C cluster as a function of simulation time for p53C and p53C-Y220C during the 100 ns MD simulation

上述研究結(jié)果表明Y220C突變會使Y220C Cluster的β-折疊含量和氫鍵減少以及親水性空腔變大。這些研究結(jié)果均可為后續(xù)的p53C-Y220C穩(wěn)定劑的開發(fā)和設(shè)計提供一定的理論基礎(chǔ)。在設(shè)計穩(wěn)定劑過程中應(yīng)該考慮使Y220C穩(wěn)定劑分子和220位氨基酸殘基周圍氨基酸(如，L145、V147、T150、D228、L257等)之間形成較強的作用力(如氫鍵等)，從而彌補Y220C突變對p53C-Y220C作用力的減弱。例如，Basse等26設(shè)計得到的Phikan083能夠和D228形成一個氫鍵，同時能夠結(jié)合到Y(jié)220C突變所形成的空腔中從而抑制該突變體構(gòu)象轉(zhuǎn)換。另外，在設(shè)計和開發(fā)p53C-Y220C穩(wěn)定劑時，也要考慮突變體和穩(wěn)定劑結(jié)合后應(yīng)該能夠降低Y220C突變所引起的親水性空腔的體積。這些均為后期Y220C突變體穩(wěn)定劑的開發(fā)奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

根據(jù)上述研究結(jié)果，可以推斷上述構(gòu)象和作用力變化的主要原因為Y220C突變破壞了220位氨基酸與它附近殘基之間的作用力，尤其是破壞了220位殘基與它周圍氨基酸殘基之間的氫鍵相互作用，從而引起Y220C cluster以及整個蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。因此，將Y220突變成其它氨基酸是否同樣會引起上述構(gòu)象轉(zhuǎn)換尚不清楚。這可能主要取決于突變后的氨基酸能否替代酪氨酸繼續(xù)與周圍的氨基酸形成較強的相互作用。若突變引起220位氨基酸殘基與其周圍的殘基之間的作用力明顯減弱可能就會引起p53C的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，否則就可能對突變體的三維結(jié)構(gòu)影響不大。后續(xù)研究應(yīng)該繼續(xù)利用全原子MD模擬方法系統(tǒng)研究Y220突變成其它氨基酸對p53C構(gòu)象的影響，從而為詳細(xì)了解Y220C影響p53C構(gòu)象轉(zhuǎn)換提供更多的信息。

4　結(jié)論

利用全原子MD模擬研究了野生型p53C和p53C-Y220C的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，Cα-RMSD結(jié)果表明Y220C突變對于整個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響不大。進(jìn)一步利用Cα-RMSF分析發(fā)現(xiàn)，Y220C突變主要影響其突變位點附近的區(qū)域，主要包含138－164和215－238位氨基酸殘基，將其命名為Y220C cluster。二級結(jié)構(gòu)分析表明Y220C突變會降低Y220C cluster的β-折疊含量。Y220C突變不僅降低了該殘基與周圍殘基所形成的氫鍵相互作用，而且降低了Y220C cluster的折疊片S3和S8之間的氫鍵數(shù)量。Y220C突變破壞了Y220C cluster的β-折疊結(jié)構(gòu)，最終使整個β-三明治結(jié)構(gòu)瓦解。并進(jìn)一步使Y220C突變所形成的親水空腔變大，加速了水分子進(jìn)入該蛋白質(zhì)內(nèi)部，最終加速了p53C的變性和聚集。

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Effect of Y220C Mutant on the Conformational Transition of p53C Probed by Molecular Dynamics Simulation

SHEN Hong-Chen1DING Ji-Yong1LI Li2LIU Fu-Feng1,3,*
(1Department of Biochemical Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072, P.R.China;2College of Marine and Environmental Sciences,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457;3College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,P.R.China)

At present,p53 is the tumor suppressor protein with the highest known frequency of mutation. Mutations in p53 will lead to the loss of its anti-cancer function and initiate cancers.The majority of the mutations in p53 are located in its core DNAbinding domain(p53C).One of the most frequent mutation in p53C is Y220C. However,the molecular mechanism of the conformational transition of the Y220C mutant of p53C remains unclear,although it is known that the Y220C mutant greatly decreases the stability of p53C.In this study, molecular dynamics(MD)simulations are used to probe the conformational transition of the Y220C mutant of p53C.The Y220C cluster including residues 138－164 and 215－238,which are strongly affected by the mutant, is identified.The Y220C mutant decreases the content of β-sheets in the Y220C cluster.The Y220C mutation not only disrupts the hydrogen bonds between the mutated residue and surrounding residues such as Leu145 and Thr155,but also weakens the hydrogen bonds between S3 and S8 of the Y220C cluster.This causes the volume of the hydrophilic cavity to increase,accelerating water molecule entry into the cavity,which eventually unfolds the protein.The above MD results explain the molecular mechanism of the Y220C mutant in the conformational transition of p53C.These findings will benefit virtual screening and design of novel stabilizers of the mutant Y220C of p53C.

April 6,2016;Revised:June 21,2016;Published online:June 22,2016.

.Email:fufengliu@tju.edu.cn;Tel:+86-22-60602717.

Cancer;p53;Residue mutation;Conformational transition;Molecular dynamics simulation

O641

10.3866/PKU.WHXB201606224

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21576199).

國家自然科學(xué)基金(21576199)資助項目?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica