何理平，曹彩輝，吳端生

（1.南華大學實驗動物學部，湖南 衡陽 421001；

2.湖南省雙峰縣中醫(yī)院，湖南 雙峰 417700）

甲苯對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響研究

何理平1，曹彩輝2*，吳端生1

（1.南華大學實驗動物學部，湖南 衡陽 421001；

2.湖南省雙峰縣中醫(yī)院，湖南 雙峰 417700）

為研究甲苯對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響，進行了一系列試驗，并對試驗數(shù)據(jù)進行分析和評估。結果表明，甲苯對紅鯽魚具有一定的遺傳毒性，會使紅鯽魚的血紅細胞的微核率，核異常率和總核異常率產生較大的影響。

甲苯；紅鯽魚；血紅細胞；微核

微核檢測技術是有毒物質（如甲苯及苯衍生物，除草劑，放射性物質等）對生物細胞遺傳損傷檢測的一種非常有用的方法[1-7]。有人用魚類微核試驗法評價水載污染及魚類的毒性效應，認為魚類微核率可以迅速可靠地反映出機體染色體損傷，DNA復制紊亂等異常狀況。

實驗紅鯽C1HD系（red crucian carp C1HD or?laboratory carassius auratus red variety C1HD）是南華大學吳端生等采用人工雌核發(fā)育技術培育的一種魚類近交系[8]。具有體型適當、體色全紅、繁殖力強、易飼養(yǎng)等優(yōu)點，特別適合于作為急性毒性實驗、化學品毒性檢測、重金屬污染和農藥殺蟲劑污染的監(jiān)測等實驗魚類。在現(xiàn)代工業(yè)高速發(fā)展的今天，甲苯及苯衍生物對水的污染也日漸加重，研究甲苯對紅鯽魚的毒理作用，可以對水環(huán)境進行監(jiān)督，對保護人類自身健康有著重要意義[9-10]。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

實驗紅鯽C1HD系100尾，健康，1.5年齡，平均體長110.5±9.1 mm，體質量45.6±6.4 g，試驗前馴養(yǎng)＞2周。試驗用魚采用半靜態(tài)方式飼養(yǎng)，魚缸試驗用水每天定時更新一半。

1.2 試驗用水及試劑

用水為曝氣3 d自來水，pH 6.54、溶氧6.21 mg·L-1，水溫（20±4）℃，水中不含甲苯。試驗試劑為分析純。

1.3 試驗器材

注射器，顯微鏡，燒杯，玻璃棒，載玻片，蓋玻片，增氣泵，紗布，溫度計，試管。

2 試驗方法

2.1 馴養(yǎng)

將紅鯽魚放在試驗用的水簇箱中，事先曝氣48 h的自來水中馴養(yǎng)1周，使魚適應試驗環(huán)境[11]。

2.2 配制甲苯溶液

根據(jù)前期試驗將甲苯濃度設置為4、8和12 mg·L-13個濃度[12]。

2.3 染毒

將40條紅鯽魚隨機分為高、中、低、對照組4組，每組25條，置一水簇箱中，染毒組分別按12、8、4 mg·kg-1（體質量）腹腔注射（從紅鯽魚胸鰭下無鱗片處小心將藥水推注入魚的腹腔中）不同濃度甲苯溶液，對照組注射0.2 mL 0.85%生理鹽水。以便于1、3、5、7 d取血制片觀察，計數(shù)。

2.4 飼養(yǎng)及水環(huán)境的維持

每一水簇箱中放一個增氣泵來增氣增氧，每天上午按大約魚體重1%投入磨細的魚餌料1次，每天換水1次，每次換水1/2～2/3。水溫保持在23～27℃。

2.5 取血制片

從各處理組中取實驗魚用紗布擦干凈，以體側取血法（將魚側臥，從軀干部的側線鱗基部，將注射針呈50°～70°刺入魚體，當遇到脊椎骨時，使針尖刺入兩個椎體之間，并輕輕轉動，便可刺破血管壁，血液隨之進入注射器內）取血制片。同時，在注射針筒底部沾少許肝素防止血液凝固[13]。

將血液直接涂在潔凈的載玻片上，自然晾干；甲醇固定4 min，瑞氏染色3 min，緩沖液覆蓋5 min；沖洗，晾干后在顯微鏡下觀察，計數(shù)。

2.6 觀察、計數(shù)和測定

將血涂片置于油鏡下觀察，計數(shù)，每張涂片至少數(shù)40個紅細胞，分別記錄微核數(shù)、微核細胞數(shù)、雙核數(shù)、小核數(shù)、無核數(shù)、其他核異常數(shù)、總異常數(shù)，結果以千分率表示。其中，微核為圓形或橢圓形，直徑約為主核的1/5～1/4；其他核異常包括核質外凸、核質內凹、核質斷裂、核位置明顯異常等；總核異常數(shù)包括微核數(shù)、雙核數(shù)、小核數(shù)、無核數(shù)和其他核異常數(shù)。

3 試驗結果

3.1 甲苯對紅鯽魚血紅細胞微核及核異常的影響

染毒1、3、5、7 d后對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響見表1～4；染毒對紅鯽魚血紅細胞微核、核異常、總核異常數(shù)的影響見圖1～3。

表1 染毒1 d后對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響

表2 染毒3 d后對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響

表3 染毒5 d后對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響

表4 染毒7 d后對紅鯽魚血紅細胞微核和核異常的影響

圖1 染毒對紅鯽魚血紅細胞微核的影響

圖2 染毒對紅鯽魚血紅細胞核異常的影響

由表1～4可知，分別染毒后，試驗組紅鯽魚活力下降，但未出現(xiàn)死亡。隨著甲苯濃度的增加及時間的延長，核異常率也明顯在發(fā)生變化；從表1～4與圖1～3中可知，甲苯對紅鯽魚外周血紅細胞的微核率、核異常率及總核異常率是具有一定影響的。微核率、核異常率與總核異常率都明顯上升，在用不同濃度的甲苯處理相同時間或用同一濃度處理不同時間后，從表1～4可知，紅鯽魚的微核率、核異常率與總核異常率都明顯上升，都明顯高于生理鹽水對照組的水平。從圖1～3可知，紅鯽魚微核率，核異常率與總核異常率均出現(xiàn)一個高峰，但并不一致，由圖2可知，各種濃度組核異常率高峰均在第7天。出現(xiàn)高峰的濃度值也不是完全同步的。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于甲苯影響紅鯽魚的途徑很多，抑制紡錘體而產生核異常和使微小核物質滯留質核外的時間及程度并不一致所致[13]。

在處理時間相同的各不同甲苯濃度組中，均以最高濃度組上升最多。由圖1～3可知，在處理1、3和5 d的各濃度中，均以12 mg·kg-1組上升最多。表明甲苯濃度越高對紅鯽魚的毒害越大，具有一定的劑量效應。圖1顯示，高濃度組第3天的微核率較第1天有所下降，原因可能為試驗失誤或取材紅鯽魚的個體差異所致。由圖2可知，第7天高濃度組的核異常率都有所下降而中低濃度組繼續(xù)上升，分析原因可能是紅鯽魚的個體差異所致，也可能是紅鯽魚對甲苯的毒害產生了一定的抵抗力。

圖3 染毒對紅鯽魚血紅細胞總核異常數(shù)的影響

由表1～3可知，在用同一甲苯濃度處理不同時間各組的比較中，發(fā)現(xiàn)每一濃度組中，隨著染毒時間的加長，紅鯽魚的血紅細胞微核率均有不同程度的上升，具有一定的時間效應。圖1表明，高濃度組在第3天的微核率有所降低。由圖2可知，在4 mg·kg-1與12 mg·kg-1濃度組中，5～7 d的核異常率有所下降，此現(xiàn)象說明紅鯽魚對甲苯的毒害作用還是有一定抵抗力的，在經過了一段時間以后，通過自身的調節(jié)，機體排除有害物質以減小毒害并且抑制核異常的產生[14]。

4 討論

隨著工農業(yè)的迅速發(fā)展，大量的甲苯及苯衍生物也隨著廢棄物進入了水體，不僅嚴重污染了水體環(huán)境；同時對水體中的主要動物魚類，產生了非常嚴重的危害。魚類又是人類重要的食物來源，這些受毒害的魚必將通過食物鏈而最終危害人類自身的健康。

甲苯及苯衍生物進入動物體內后，具有較為強烈的致突變、致畸和致癌作用，同時又因為甲苯及苯衍生物具有難以被生物分解和較高的富集等特性，當環(huán)境中甲苯及苯衍生物的含量超過一定的濃度時，如果長期生活在這樣的環(huán)境中，就會對包括人類在內的所有生物造成極大的毒害作用[15]。

微核實驗是染色體損傷短期突變性試驗方法之一，有關微核的產生原因，不同的學者雖有不同的表述，但基本上意見是一致的，即微核是細胞在有絲分裂時因為各種有害因素的損傷，使細胞核殘留在核外的微小染色質塊，一般認為無著絲粒斷片可形成小微核，紡錘體斷裂造成的一條或一組染色體滯后可形成大微核。由于微核與染色質的突變具有較為密切的聯(lián)系，因此長期以來微核被許多科研工作者用來作為評價毒物，放射性物質以及細胞毒性物質對人、動物及體外細胞損傷的指標?，F(xiàn)在微核檢測技術是檢測有毒物質對生物細胞遺傳損傷的一個非常有用的指標，微核率可以迅速、可靠地反映機體染色體損傷及DNA復制紊亂等異常狀況[16]。

5 結論

苯及苯衍生物甲苯對紅鯽魚具有一定的遺傳毒性，能對紅鯽魚的血紅細胞的微核率、核異常率和總核異常率產生較大的影響。

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Effects of Toluene on Micronuclei and Nuclear Anomalies in Red Blood Cells of Red Crucian Carp

HE Liping1,CAO Ca ihui2*,WU Duansheng1
（1.Department of Laboratory Animal,Nanhua University,Hengyang 421001,Hunan,China)
2.Shuangfeng Chinese Medicine Hospital of Hunan Province,Shuangfeng,417700,Hunan,China）

In order to study the effect of toluene on micronuclei and nuclear anomalies in red blood cells of red crucian carp,a series of experiments were done and the test data were analyzed and evaluated.The results showed that toluene had genetic toxicity on red crucian carp,and would impact the red blood cell micronuclei rate,nuclear abnor?mal rate andtotal nuclear abnormalities rate of redcruciancarp.

toluene;red crucian carp;red blood cells;micronucleus

O625.11；Q959.4

A

1001-0084（2016）10-0005-05

2016-09-10

湖南省科技廳資助項目（2013TT2015）

何理平（1980-），女，湖南雙峰人，碩士，講師，主要從事實驗動物飼養(yǎng)。

*通訊作者