向 導(dǎo)

（湖南省湘西自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南吉首 416000）

家畜布魯氏菌病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

向 導(dǎo)

（湖南省湘西自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南吉首 416000）

近年來(lái)，布魯氏菌病的發(fā)生形勢(shì)嚴(yán)峻，為了掌握湘西州現(xiàn)階段布魯氏菌病疫源和疫病流行規(guī)律，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情隱患，有針對(duì)性地開展布魯氏菌病預(yù)防控制工作。對(duì)轄區(qū)內(nèi)牛、羊開展抽樣檢測(cè)。本次試驗(yàn)對(duì)湘西州的681份樣品進(jìn)行檢測(cè)。首先，用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初篩，檢出可疑樣品再用試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)。

布魯氏菌病 虎紅平板凝集試驗(yàn) 試管凝集試驗(yàn)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人、畜共患傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可由牛、羊、豬傳染人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。本病廣泛分布于世界各地，我國(guó)目前在人、畜間仍有發(fā)生，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。在對(duì)布魯氏菌病診斷中，流行病學(xué)資料，流產(chǎn)、胎兒胎衣的病理?yè)p害，胎衣滯留以及不育等都有助于布魯氏菌病的診斷，但確診只有通過實(shí)驗(yàn)室診斷才能得出結(jié)果?？煞譃椴≡瓕W(xué)檢測(cè)方法和血清學(xué)檢測(cè)方法。其中病原學(xué)檢測(cè)方法分為顯微鏡檢查、病原分離鑒定、分子生物學(xué)檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)方法分為虎紅平板凝集試驗(yàn)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)。我國(guó)目前檢測(cè)布魯氏菌病常用的方法是虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，本次試驗(yàn)用的是以上兩種方法對(duì)湘西州681份樣品進(jìn)行了檢測(cè)?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果分析如下：

1 材料與方法

1.1 材料

待檢樣品采集于湘西州各縣市的規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的5月齡以上的羊和8月齡以上的牛樣品，其中牛樣品291份，羊樣品391份，待檢樣品存放于-20 ℃。

1.2 診斷試劑

布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清和試管凝集試驗(yàn)抗原、血清由湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，生產(chǎn)廠家是青島易幫生物，虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原批號(hào)是20120726、陽(yáng)性血清批號(hào)是20120726，試管凝集試驗(yàn)抗原批號(hào)是20120726、陽(yáng)性血清批號(hào)是20120504。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 準(zhǔn)備工作

（1）血樣采集和血清的制備：將牛、羊保定好采用頸靜脈采血，血樣采好后，用記號(hào)筆在離心管上標(biāo)記好編號(hào)，一頭牛、羊樣品一個(gè)編號(hào)，采好后的血樣放置一晚，第二天再離心，析出血清效果好。離心后的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)后需保存的血清樣品放入-20℃保存。

（2）做虎紅平板凝集試驗(yàn)需準(zhǔn)備的有：潔凈的玻璃板，在玻璃板上用記號(hào)筆畫好大概4cm2的方格。

（3）試管凝集試驗(yàn)的準(zhǔn)備：稀釋液：0.5%石炭酸生理鹽水，檢驗(yàn)羊血清時(shí)用0.5%石炭酸的10%鹽溶液。凝集試驗(yàn)管、試管架、溫箱、移液器等。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查方法

（1）虎紅平板凝集試驗(yàn)方法：在玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(hào)，然后用移液槍加相應(yīng)血清0.03ml，再在受檢血清旁滴加抗原0.03ml，用吸管或牙簽類小棒攪動(dòng)血清和抗原使之均勻混合。再雙手拿起玻璃板稍微來(lái)回輕晃數(shù)次，在室溫下4分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。每次試驗(yàn)還需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。在陽(yáng)性、陰性對(duì)照成立的條件下，受檢血清在4分鐘內(nèi)呈現(xiàn)肉眼可見不同程度的顆粒狀或絮狀的凝集現(xiàn)象可判為陽(yáng)性，完全不凝集呈均勻粉紅色的判為陰性。

（2）試管凝集試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)按照＜＜動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)規(guī)程GB/T18646——2002＞＞進(jìn)行，羊和牛的受檢血清稀釋方法基本一致，差異是第一管加的稀釋液和受檢血清的量有所不同?，F(xiàn)以羊?yàn)槔?，第一只管?biāo)記好編號(hào)用移液槍加1.15ml；第2～4管加0.5ml稀釋液；然后用吸管吸取受檢血清0.1ml，加入第一管內(nèi)，并混合均勻。充分混勻后吸取該管混合液0.25ml棄去；再取0.5ml合液加入第二管混合均勻，再取第二管混合液0.5ml加至第三管混勻，如此倍比稀釋至第四管，從第四管棄去混勻液0.5ml。稀釋完畢，從第一至第四管的血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50、1：100。然后將0.5ml的20倍稀釋的抗原加入各管中，并振搖均勻。羊的血清稀釋度為1：25、1：50、1：100、1：200；牛的稀釋度為1：50、1：100、1：200、1：400。置37-40℃度溫箱24小時(shí)，再取出檢查并記錄結(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)做比濁管和陽(yáng)性、陰性、抗原對(duì)照。

陽(yáng)性、陰性對(duì)照稀釋和加抗原的方法與受檢血清相同，做抗原對(duì)照的目的是觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。每次試驗(yàn)需配比濁管，作為判定凝集反應(yīng)程度的依據(jù)。

（3）結(jié)果判定：如果試管底部出現(xiàn)點(diǎn)狀或圓盤狀沉淀，則不需要比較清亮度，如果試管底部出現(xiàn)倒傘狀沉淀，則需要比濁管比較液體清亮度。牛1：100血清稀釋，羊1：50血清稀釋出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為陽(yáng)性。牛1：50血清稀釋，羊1：25血清稀釋出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為可疑反應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過用虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)681份牛羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè) ，其中羊血清樣品中檢測(cè)出13份出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，用試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)出8份陽(yáng)性。

表1 虎紅平板凝集試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果（單位：份）

表2 試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（單位：份）

3 討論分析

布魯氏菌病來(lái)勢(shì)兇猛，并呈擴(kuò)大蔓延的趨勢(shì)，有必要進(jìn)行布魯氏菌病的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。布魯氏菌病的分離受實(shí)驗(yàn)室條件的限制，很難開展分離工作。因此，對(duì)血清抗體的檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便易行具有良好的敏感性和特異性的方法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）檢測(cè)羊布魯氏菌病，681頭共檢測(cè)出陽(yáng)性13份，而用試管凝集試驗(yàn)（SAT）則檢測(cè)出陽(yáng)性8份，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出RBPT檢測(cè)血清樣品存在假陽(yáng)性。RBPT敏感性高，特異性低，說明RBPT可用于樣品的初步檢疫的篩選，因RBPT方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉所以檢測(cè)該方法適用于布魯氏菌病的大面積檢疫和流行病學(xué)的調(diào)查。

SAT是我國(guó)檢測(cè)布魯氏菌病診斷的法定方法。是一種比較經(jīng)典的布魯氏菌病的檢測(cè)方法，它可以定性，也可以定量。因而在判定反應(yīng)強(qiáng)度上比RBPT更精確。SAT檢測(cè)Igm敏感性較高，可作為布魯氏菌病的早期診斷，同時(shí)可用于人畜布魯氏菌菌苗免疫后的機(jī)體最早期血清學(xué)抗體的檢測(cè)，此法優(yōu)點(diǎn)是判定容易，具有較高的診斷價(jià)值。但不能區(qū)分人工免疫和自然感染，而且部分感染的動(dòng)物抗體滴度達(dá)不到檢測(cè)水平，因而造成漏診和誤診。

RBPT在使用的時(shí)候操作方便，快捷，適用于大規(guī)模的篩選檢疫，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性。SAT特異性高，比較準(zhǔn)確，但操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不適用于大規(guī)模的檢疫。在實(shí)際操作過程中，采用這兩種方法，互補(bǔ)優(yōu)劣。先用RBPT篩選，陽(yáng)性樣品再用SAT檢測(cè)做出比較準(zhǔn)確的判斷。通過上述兩種方法，檢測(cè)出陽(yáng)性畜。說明湘西某養(yǎng)羊場(chǎng)確實(shí)存在布魯氏菌病的感染，進(jìn)一步做好檢疫、淘汰、凈化。近年又出現(xiàn)ELISA這種新的檢測(cè)方法，本試驗(yàn)較傳統(tǒng)的SAT試驗(yàn)敏感性要高許多。這將可能作為標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法進(jìn)一步推廣。

［1］馮元璋.血清學(xué)技術(shù)在布病診斷上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，10（1）：79-87.

［2］呂燕，顧春燕.平板凝集反應(yīng)和試管凝集反應(yīng)相結(jié)合檢測(cè)布魯氏桿菌?。跩］.內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，2002，（4）：29.

［3］徐百萬(wàn).動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［4］朱作鋒.2004動(dòng)物防疫新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程與管理法規(guī)手冊(cè)［M］.北京：光明日?qǐng)?bào)出版社，2004.