孫　輝，何勝利（1.南陽市中心醫(yī)院急診內(nèi)科，河南南陽　473009；2.遂成藥業(yè)股份有限公司，河南新鄭451150）

HPLC法同時測定蟾龍定喘合劑中5種成分的含量

孫輝1＊，何勝利2#（1.南陽市中心醫(yī)院急診內(nèi)科，河南南陽473009；2.遂成藥業(yè)股份有限公司，河南新鄭451150）

目的：建立同時測定蟾龍定喘合劑中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Welch Materials C18，流動相為乙腈-甲醇（1∶1，V/V）-水（梯度洗脫），流速為0.9 ml/min，檢測波長為246 nm（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）、270 nm（朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為8.24～164.80 μg/ml（r=0.999 7）、5.15～103.00 μg/ml（r= 0.999 3）、4.06～81.20 μg/ml（r=0.999 6）、5.88～117.60 μg/ml（r=0.999 5）、4.90～98.00 μg/ml（r=0.999 8）；定量限分別為0.385、0.179、0.124、0.218、0.348 μg/ml，檢測限分別為0.127、0.059、0.041、0.072、0.115 μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.93%～100.06%（RSD=0.80%，n=6）、96.91%～100.16%（RSD=1.37%，n=6）、96.95%～99.63%（RSD=0.98%，n=6）、96.69%～99.33%（RSD=1.03%，n=6）、96.76%～98.53%（RSD=0.70%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果可靠，適用于同時測定蟾龍定喘合劑中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量。

高效液相色譜法；蟾龍定喘合劑；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；朝藿定B；朝藿定C；淫羊藿苷

蟾龍定喘合劑由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、麻黃、蟾蜍、地龍、五味子、桂枝、紅參、黃芪、當(dāng)歸、白芍、陳皮、清半夏、杏仁、干姜、豬膽汁、炙甘草、桔梗、紫蘇葉等19味中藥材組成，為中藥復(fù)方制劑，有散寒化痰、補(bǔ)肺益腎、止咳定喘的功效，可用于肺腎氣虛性慢性支氣管炎、虛寒性支氣管哮喘、痰白多沫等證。該制劑收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（第二冊）［1］，原蟾龍定喘合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對麻黃作了規(guī)定，不能有效控制蟾龍定喘合劑的質(zhì)量。補(bǔ)骨脂和淫羊藿為蟾龍定喘合劑方中的主要藥物，補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效；淫羊藿具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。因此，為更好地控制蟾龍定喘合劑的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定補(bǔ)骨脂的主要成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，淫羊藿的主要成分朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量。

1　材料

1.1儀器

1200型HPLC儀，包括G1315B可變波長檢測器（美國Agilent公司）；BP-211D型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：40 W，頻率：150 kHz）。

1.2藥品與試劑

蟾龍定喘合劑（內(nèi)蒙古仁澤藥業(yè)有限公司，批號：20140401、20140709、20150317，規(guī)格：100 ml/瓶）；補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110739-201416，純度：99.9%）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110738-201313，純度：100.0%）、朝藿定C對照品（批號：111780-200801，純度：100.0%）和淫羊藿苷對照品（批號：110737-200415，純度：100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；朝藿定B對照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：110623-73-9，純度：98.0%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Welch Materials C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇（1∶1，V/V）（A）-水（B）；流速為0.9 ml/min，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測波長：246 nm（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）［2-4］、270 nm（朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷）［5-7］；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷對照品適量，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇制成骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷質(zhì)量濃度分別為0.824、0.515、0.406、0.588、0.490 mg/ml的單一對照品貯備液。分別吸取上述各單一對照品貯備液2.5、2.0、2.5、2.5、1.5 ml，置于同一50 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的質(zhì)量濃度分別為0.041 2、0.020 6、0.020 3、0.029 4、0.014 7 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液精密量取樣品1.5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇定容，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，取出放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。

2.2.3陰性對照溶液按樣品的制備工藝和配方比例，分別取缺補(bǔ)骨脂和淫羊藿的其余藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備補(bǔ)骨脂陰性對照溶液和淫羊藿陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、補(bǔ)骨脂陰性對照溶液和淫羊藿陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)均≥3 000。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各單一對照品貯備液0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制得系列線性溶液。取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），結(jié)果詳見表3。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.78%、0.85%、0.98%、1.03%、1.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.補(bǔ)骨脂陰性對照；D.淫羊藿陰性對照；1.補(bǔ)骨脂素；2.異補(bǔ)骨脂素；3.朝藿定B；4.朝藿定C；5.淫羊藿苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control of psoralen；D.negative control of icariin；1.psoralen；2.isopsoralen；3.epimedin B；4.epimedin C；5.icariin

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

表3　檢測限與定量限測定結(jié)果（μg/ml）Tab 3　Determination results of quantitation limit and detection limit（μg/ml）

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：20150317）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.80%、0.86%、1.05%、0.76%、0.69%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號：20150317）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.76%、0.82%、0.56%、0.63%、0.70%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：20150317）6份，每份0.75 ml，分別置于50 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液25 ml、甲醇20 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of the recovery tests（n=6）

2.10樣品含量測定

取3批樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表5。

表5　樣品含量測定結(jié)果（n=6，mg/ml）Tab 5　Results of contents determination of samples（n=6，mg/ml）

3　討論

筆者在試驗(yàn)過程中考察了多種流動相系統(tǒng)，包括乙腈-甲醇（1∶2，V/V）-水［8-9］、乙腈-甲醇（1∶1，V/V）-水［10-11］、乙腈-水［12-14］，以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的出峰時間、峰形和分離度效果為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，優(yōu)選出最佳流動相。結(jié)果表明，乙腈-甲醇（1∶1，V/V）-水為流動相時，文中所測5個成分的色譜峰出峰時間、峰形和分離度效果最佳。故本試驗(yàn)選取乙腈-甲醇（1∶1，V/V）-水為流動相。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果可靠，適用于同時測定蟾龍定喘合劑中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第二冊［S］.（WS3-B-4048-98）.1990.

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of 5Components in Chanlong Dingchuan Mixture by HPLC

SUN Hui1，HE Shengli2（1.Dept.of Emergency Medicine，Nanyang Center Hospital，Henan Nanyang 473009，China；2.Suicheng Pharmaceutical Co.，Ltd.，Henan Xinzheng 451150，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of psoralen，isopsoralen，epimedin B，epimedin C and icariin in Chanlong dingchuan mixture.METHODS：HPLC was performed on the column of Welch Materials C18with mobile phase of acetonitrile-methanol（1∶1，V/V）-water（gradient elution）at a flow rate of 0.9 ml/min，the detection wavelength was 246 nm（psoralen，isopsoralen）and 270 nm（epimedin B，epimedin C and icariin），column temperature was 30℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 8.24-164.80 μg/ml for psoralen（r=0.999 7），5.15-103.00 μg/ml for isopsoralen（r=0.999 3），4.06-81.20 μg/ml for epimedin B（r=0.999 6），5.88-117.60 μg/ml for epimedin C（r=0.999 5）and 4.90-98.00 μg/ml for icariin（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 0.385 μg/ml，0.179 μg/ml，0.124 μg/ml，0.218 μg/ml and 0.348 μg/ml，limits of detection were 0.127 μg/ml，0.059 μg/ml，0.041 μg/ml，0.072 μg/ml and 0.115 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 97.93%-100.06%（RSD=0.80%，n=6），96.91%-100.16%（RSD=1.37%，n=6），96.95%-99.63%（RSD=0.98%，n=6），96.69%-99.33%（RSD=1.03%，n=6）and 96.76%-98.53%（RSD=0.70%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and reliable，and suitable for the simultaneous determination of psoralen，isopsoralen，epimedin B，epimedin C and icariin in Chanlong dingchuan mixture.

HPLC；Chanlong dingchuan mixture；Psoralen；Isopsoralen；Epimedin B；Epimedin C；Icariin

R917

A

1001-0408（2016）27-3880-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.46

＊主治醫(yī)師。研究方向：急診內(nèi)科臨床及相關(guān)藥物。E-mail：sunhuixs@163.com

工程師。研究方向：藥物制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0371-62599489。E-mail：13803995445@163.com

（2015-09-30

2016-07-03）