孫紅爽 乜春城 朱小麗 馬紅芳 陳赫軍 種寶貴

·論著·

11β-HSD1在糖皮質(zhì)激素聯(lián)合高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗中的作用

孫紅爽 乜春城 朱小麗 馬紅芳 陳赫軍 種寶貴

目的通過(guò)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合高脂喂養(yǎng)建立胰島素抵抗動(dòng)物模型，探討11β-羥類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)在該模型中的表達(dá)和意義。方法32只雄性Wistar大鼠，按體重隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、地塞米松組、高脂飲食組、高脂+地塞米松組(HFD+DEX組)，每組8只。對(duì)照組和地塞米松組喂以普通飼料，高脂飲食組和HFD+DEX組喂以高脂飼料，8周后地塞米松組和HFD+DEX組輔以地塞米松刺激，12周后進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，檢測(cè)血糖、血脂、血胰島素及皮質(zhì)酮水平，計(jì)算肝指數(shù)、內(nèi)臟肥胖指數(shù)及穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗(HOMA-IR)指數(shù)，檢測(cè)11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，其余3組均出現(xiàn)胰島素抵抗，表現(xiàn)為：胰島素耐量試驗(yàn)不敏感(注射胰島素30 min后對(duì)照組、高脂飲食組、地塞米松組和HFD+DEX組血糖值分別下降了44.15%，28.14%，32.58%，13.53%)、高血糖、高胰島素血癥、血脂紊亂(總膽固醇、甘油三酯及游離脂肪酸升高，高密度脂蛋白-膽固醇降低)、HOMA-IR指數(shù)、肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)升高，且HFD+DEX組各項(xiàng)指標(biāo)變化幅度最大(F=10.89～213.20，P<0.05或P<0.01)。另外，與對(duì)照組相比，其余3組內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)水平也明顯升高，且HFD+DEX組明顯高于高脂飲食組及地塞米松組(F=32.64～116.00,P均<0.01)。結(jié)論地塞米松聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)可成功建立大鼠胰島素抵抗模型，內(nèi)臟脂肪組織中11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)升高，可能與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)。

11β-羥類固醇脫氫酶1；糖皮質(zhì)激素；地塞米松；高脂飲食；大鼠

胰島素抵抗(IR)是糖尿病、高血壓、肥胖、非酒精性脂肪性肝病、心腦血管疾病等的重要發(fā)病因素，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的研究已成為國(guó)內(nèi)、外熱點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素是一種胰島素的反向調(diào)節(jié)激素，可對(duì)抗胰島素的降血糖作用，無(wú)論是內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素增多，還是長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素類藥物，均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)IR。11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSD)1在體內(nèi)具有脫氫和還原雙重作用，催化糖皮質(zhì)激素從無(wú)活性的可的松轉(zhuǎn)化為有活性的氫化可的松，繼而與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，因此又被稱為糖皮質(zhì)激素的放大器。目前IR的動(dòng)物模型建立多通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)完成，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)可起協(xié)同作用，惡化高脂飲食導(dǎo)致的IR、脂質(zhì)紊亂等[1-2]。本研究在原有造模方式上進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)高脂喂養(yǎng)聯(lián)合糖皮質(zhì)激素建立大鼠IR模型，并分析11β-HSD1在地塞米松惡化高脂喂養(yǎng)大鼠IR、血脂紊亂中的作用，為IR及其相關(guān)疾病的藥物治療確立新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性Wistar大鼠32只，由河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～220 g，清潔級(jí)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2005-0001，動(dòng)物批號(hào)：410116。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，32只大鼠按體重隨機(jī)區(qū)組法分成4組：對(duì)照組、地塞米松組、高脂飲食組、高脂+地塞米松組(HFD+DEX組)，每組8只。對(duì)照組和地塞米松組喂以普通飼料，高脂飲食組和HFD+DEX組喂以自制高脂飼料(配方為：25%豬油，5%糖，2%膽固醇，2%食鹽，66%基礎(chǔ)飼料)；8周后地塞米松組和HFD+DEX組再輔以地塞米松刺激，每天8:00及20:00皮下注射地塞米松0.1 mg/kg。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)在恒溫[(23±2)℃]、恒濕[(60±5)%]環(huán)境中，明暗周期12 h，自由取食飲水。每周稱量體重、進(jìn)食量，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行12周后測(cè)量相關(guān)指標(biāo)。

1.2 試劑與儀器 游離脂肪酸(FFA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20090512)；甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，2009014)；胰島素、皮質(zhì)醇放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所，20090520)；地塞米松注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：0908012，規(guī)格：1 ml∶5 mg×10盒)；兩步法RT-PCR試劑盒(Takara公司)；11β-HSD1抗體(Santa Cruz公司)；SureStep Plus穩(wěn)步倍加型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；T6紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；M-96型16管手動(dòng)放射免疫γ計(jì)數(shù)器(合肥眾成生物工程設(shè)備有限公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)MJ Research 公司)；Western-blotting儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.1 胰島素耐量試驗(yàn) 12周后，進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.3.5 內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1蛋白表達(dá) 每組取3只動(dòng)物的凍存脂肪組織，提取組織蛋白進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。上樣量10 μl，14.7%分離膠、5%濃縮膠，60 V電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉2 h，以兔抗小鼠11β-HSD1多克隆抗體為一抗(1∶200稀釋)，4℃過(guò)夜，以羊抗兔IgG-HRP抗體為二抗(1∶800稀釋)，室溫作用2 h，ECL檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所得條帶在Bandscan分析軟件中測(cè)得各自的總灰度值，進(jìn)行定量分析，并用自身β-actin灰度值校正。

2 結(jié)果

2.1 各組體重變化 高脂飼料喂養(yǎng)可使大鼠體重增加更明顯，從第10周開(kāi)始高脂飲食組體重明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；地塞米松刺激可使大鼠體重增加緩慢，但地塞米松組與對(duì)照組及HFD+DEX組與高脂飲食組之間差異均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

注：control：對(duì)照組；HFD：高脂飲食組；DEX：地塞米松組；HFD+DEX：高脂+地塞米松組；與對(duì)照組相比，aP<0.05圖1 4組Wistar大鼠體重變化情況

2.2 各組進(jìn)食量變化 高脂飼料喂養(yǎng)使大鼠單位體重的進(jìn)食量明顯減少，從第8周開(kāi)始高脂飲食組及HFD+DEX組進(jìn)食量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；與高脂飲食組比較，地塞米松刺激2周后HFD+DEX組進(jìn)食量增加(P<0.05)，4周后增加更明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：control：對(duì)照組；HFD：高脂飲食組；DEX：地塞米松組；HFD+DEX：高脂+地塞米松組；與對(duì)照組相比，aP<0.05；與HFD組相比，bP<0.05， cP<0.01 圖2 4組Wistar大鼠進(jìn)食量變化情況

2.3 各組胰島素耐量試驗(yàn)情況 高脂飲食組與HFD+DEX組的基礎(chǔ)血糖(0 min 時(shí)血糖值)與對(duì)照組相比升高(P<0.01)。腹腔注射胰島素30 min后，與基礎(chǔ)血糖值相比，對(duì)照組、高脂飲食組、地塞米松組和HFD+DEX組分別下降了44.15%，28.14%，32.58%，13.53%。3組曲線下面積與對(duì)照組相比均顯著升高(P均<0.05)，且HFD+DEX組升高最明顯(P<0.01),見(jiàn)圖3。

2.4 各組肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)比較 與對(duì)照組相比，其余3組肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)均明顯增加(P均<0.05)，且以HFD+DEX組最為明顯，見(jiàn)圖4。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食和地塞米松刺激對(duì)肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)增加均有明顯影響(P<0.01)；且兩因素對(duì)內(nèi)臟肥胖指數(shù)升高有協(xié)同作用(F=4.88,P<0.05)。

2.5 各組血液生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，其余3組血糖、胰島素及HOMA-IR均明顯升高(P均<0.01)，且HFD+DEX組明顯高于高脂飲食組及地塞米松組(P均<0.01)。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食、地塞米松刺激對(duì)血糖、胰島素及HOMA-IR的升高均有明顯影響(P<0.01)，兩因素對(duì)HOMA-IR的升高有明顯協(xié)同作用(F=10.05,P<0.01)，見(jiàn)表1。

與對(duì)照組相比，其余3組血液皮質(zhì)酮水平均明顯升高(P<0.01)，地塞米松組高于高脂飲食組(P<0.01)，而HFD+DEX組高于地塞米松組(P<0.01)。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食、地塞米松刺激對(duì)皮質(zhì)酮的升高有明顯影響(P<0.01)，且兩因素存在協(xié)同作用(F=5.45,P<0.05)。

注:A:不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平;B:曲線下面積;control:對(duì)照組;HFD:高脂飲食組;DEX:地塞米松組;HFD+DEX:高脂+地塞米松組;AUC:曲線下面積;與對(duì)照組相比,aP<0.05,bP<0.01;與HFD組相比,cP<0.01;與地塞米松組相比,dP<0.01圖3 4組Wistar大鼠胰島素耐量的比較(x±s,n=8)

與對(duì)照組相比，其余3組總膽固醇、甘油三酯及游離脂肪酸均明顯升高(P均<0.01)，HDL-C明顯下降(P<0.01)，且以HFD+DEX組最為明顯。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食、地塞米松刺激對(duì)總膽固醇、甘油三酯及游離脂肪酸升高和HDL-C下降均有明顯影響(P<0.01)；兩因素對(duì)HDL-C下降有明顯協(xié)同作用(F=37.69,P<0.01)，對(duì)總膽固醇及游離脂肪酸升高也有協(xié)同作用(F=6.61,P<0.05;F=4.72,P<0.05)。

2.6 各組內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，其余3組內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1 mRNA表達(dá)均明顯升高，且HFD+DEX組明顯高于高脂飲食組及地塞米松組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食、地塞米松刺激對(duì)內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1 mRNA表達(dá)均有明顯影響(P<0.01)，且兩因素存在協(xié)同作用(F=8.69,P<0.05)。

注:control:對(duì)照組;HFD:高脂飲食組;DEX:地塞米松組;HFD+DEX:高脂+地塞米松組;與對(duì)照組相比,aP<0.05;bP<0.01;與HFD組相比,cP<0.01;與DEX組相比,dP<0.01圖4 4組Wistar大鼠肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)比較(x±s,n=8)

表1 4組Wistar 大鼠的血液指標(biāo)情況

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01；與高脂飲食組相比，dP<0.05,bP<0.01；與地塞米松組相比，cP<0.01；HFD+DEX組：高脂+地塞米松組；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)

注：control：對(duì)照組；HFD：高脂飲食組；DEX：地塞米松組；HFD+DEX：高脂+地塞米松組；11β-HSD1：11β-羥類固醇脫氫酶1；與對(duì)照組相比， aP<0.01；與HFD組相比，bP<0.01；與DEX組相比，cP<0.01圖5 11β-HSD1基因在4組Wistar大鼠內(nèi)臟脂肪組織中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，其余3組內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1蛋白表達(dá)均明顯升高，且HFD+DEX組明顯高于高脂飲食組及地塞米松組(P<0.01)，見(jiàn)圖6。2×2方差分析結(jié)果顯示，高脂飲食、地塞米松刺激對(duì)內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1 mRNA表達(dá)均有明顯影響(P<0.01)，兩因素不存在協(xié)同作用(F=2.57,P>0.05)。

注：control：對(duì)照組；HFD：高脂飲食組；DEX：地塞米松組；HFD+DEX：高脂+地塞米松組；11β-HSD1：11β-羥類固醇脫氫酶1；與對(duì)照組相比，aP<0.05,bP<0.01；與HFD組相比，cP<0.01；與DEX組相比，d P<0.01 圖6 11β-HSD1蛋白在4組Wistar大鼠內(nèi)臟脂肪組織中的表達(dá)

3 討論

目前關(guān)于IR及其動(dòng)物模型的研究很多，多數(shù)通過(guò)單純高脂飼料喂養(yǎng)使動(dòng)物產(chǎn)生IR，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)可起協(xié)同作用，惡化高脂飲食導(dǎo)致的IR、血脂紊亂等[1-2]。慢性應(yīng)激是一種對(duì)長(zhǎng)期精神緊張的模擬，如快速生活節(jié)奏、工作壓力導(dǎo)致的長(zhǎng)期精神緊張，可通過(guò)激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，導(dǎo)致體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平升高，從而發(fā)揮作用。也有部分研究采用藥物與高脂飲食相結(jié)合的方式造模。張小華等[4]通過(guò)高脂喂養(yǎng)結(jié)合地塞米松隔日腹腔注射的方式8周后造模成功，但是報(bào)道中注射地塞米松動(dòng)物的死亡率較高，達(dá)20%～30%。因此本研究對(duì)原有高脂飼料配方及地塞米松刺激方式做了改進(jìn)，高脂飼料中增加了膽固醇的含量，地塞米松刺激改為每天皮下注射4周。本次研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期高脂飼料喂養(yǎng)可引起一定程度的IR，具體表現(xiàn)為：血脂紊亂、高血糖、高胰島素血癥、肝指數(shù)及內(nèi)臟肥胖指數(shù)增加等，胰島素耐量試驗(yàn)也顯示動(dòng)物處于IR狀態(tài)。皮下注射地塞米松可進(jìn)一步惡化高脂飲食引起的IR，各相關(guān)指標(biāo)變化更加明顯，且高脂飲食和地塞米松對(duì)血脂、血皮質(zhì)酮、HOMA-IR及內(nèi)臟肥胖指數(shù)存在協(xié)同作用。表明本研究采用皮下注射地塞米松聯(lián)合高脂飲食的方式建立大鼠IR模型成功。另外，本研究結(jié)果顯示皮下注射地塞米松后大鼠體重增加緩慢，進(jìn)食量增加，血液皮質(zhì)酮水平升高，與現(xiàn)有報(bào)道一致[5-6]。

本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其余3組內(nèi)臟脂肪組織11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)均升高，且HFD+DEX組升高最明顯，這種變化趨勢(shì)與各組動(dòng)物的IR狀態(tài)相吻合。11β-HSD1是糖皮質(zhì)激素代謝的關(guān)鍵酶，催化其從無(wú)活性的可的松轉(zhuǎn)化為有活性的氫化可的松，繼而與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，對(duì)抗胰島素的降血糖作用[7]。除此之外，其還可以直接影響胰島素的分泌[8]。11β-HSD1在體內(nèi)分布廣泛，主要在肝臟、脂肪組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血管平滑肌等糖皮質(zhì)激素的靶器官表達(dá)。局部組織內(nèi)11β-HSD1的活化以及調(diào)節(jié)作用異常，是IR的重要發(fā)病機(jī)制。敲除11β-HSD1基因后，小鼠體內(nèi)11-脫氫皮質(zhì)酮不能轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮，糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低，從而避免飲食所引起的肥胖及其他代謝綜合征的表現(xiàn)，如IR及高血糖[9]。Okazaki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病小鼠模型中給予選擇性11β-HSD1抑制劑能夠降低空腹血糖及胰島素水平，減少肝糖輸出，增加胰島素敏感性。由此推測(cè)下調(diào)11β-HSD1表達(dá)或敲除11β-HSD1基因?qū)τ贗R的高危人群有保護(hù)作用。

由于11β-HSD1非選擇性抑制劑可同時(shí)抑制腎臟中11β-HSD2的活性，可引起高血壓、低鉀性堿中毒等不良反應(yīng)[11]。因此，目前對(duì)于11β-HSD1抑制劑的研究主要集中在選擇性11β-HSD1抑制劑。芳基磺酰噻唑衍生物包括BVT.528、BVT.14225和VT.2733，前兩者能夠有效抑制人11β-HSD1水平，后者能抑制鼠11β-HSD1水平[12]。研究發(fā)現(xiàn)，BVT.2733能夠降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6-磷酸酶mRNA水平，降低血糖及胰島素的濃度，改善IR[13]。近些年研究發(fā)現(xiàn)的INCB-13739以及DIO-902，作為新型11β-HSD1選擇性抑制劑，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。這兩種藥物除了降低血糖、改善IR之外，還能夠有效降低血壓、血脂，減輕體重[14-15]。另外，近期有研究發(fā)現(xiàn)某些中草藥也具有選擇性抑制11β-HSD1的作用。大黃素是大黃和虎杖的提取物，是一種11β-HSD1的強(qiáng)效選擇性抑制劑，可以抑制糖皮質(zhì)激素的作用，改善糖尿病患者的血糖水平和IR狀態(tài)[16]?？喙咸崛∥镆簿哂羞x擇性抑制11β-HSD1活性，可用于治療2型糖尿病[17]。

綜上所述，本文采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合皮下注射地塞米松的方式成功誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)IR，為該病的發(fā)病機(jī)制研究及藥物試驗(yàn)提供一種可靠而簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型。本研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織中11β-HSD1的表達(dá)水平與IR狀態(tài)呈正相關(guān)，11β-HSD1可能作為IR及其相關(guān)疾病治療的新靶點(diǎn)，但是11β-HSD1在IR發(fā)病中的具體作用通路有待進(jìn)一步研究。

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Effectsof11β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1oninsulinresistanceinratsinducedbyglucocorticoidandhighfatdiet

SunHongshuang*,NieChuncheng,ZhuXiaoli,MaHongfang,ChenHejun,ChongBaogui.*

DepartmentofPharmaceutical,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hengshui053000,China

NieChuncheng,Email：niechuncheng@163.com

ObjectiveTo set up an insulin-resistant (IR) animal model by glucocorticoid and high-fat diet, and investigate the expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1) in this model and its significance.MethodsThirty-two male Wistar rats were randomly divided into four groups according to body weight randomized blocks: control group, dexamethasone group (DEX group),high-fat diet group (HFD group),and high-fat diet plus dexamethasone group (HFD+DEX group), with 8 rats in each group. Rats in control group and DEX group were fed with standard rat chow diet, while rats in HFD group and HFD+DEX group were fed with fat- and sugar-enriched diet. After 8 weeks,dexamethasone was injected subcutaneously to DEX group and HFD+DEX group. After 12 weeks, insulin tolerance test was performed, and levels of blood glucose, lipid, insulin and corticosterone were measured. Liver index, visceral obesity index and homeostasis model assessment for insulin resistance (HOMA-IR) were calculated,the expression of 11β-HSD1 gene and protein were measured.ResultsCompared with control group, IR was successfully induced in the other three groups, characterized by insensitivity in insulin tolerance test (30 minutes after insulin injection, blood glucose decreased by 44.15%,28.14%,32.58% or 13.53% in control group,HFD group,DEX group and HFD+DEX group, respectively), hyperglycosemia, hyperinsulinemia, dyslipidemia (elevated total cholesterol, triglyceride and free fatty acids, but reduced high density lipoprotein cholesterol), and the increase of HOMA-IR, hepatic index and visceral obesity index, especially in HFD+DEX group (F=10.89-213.20,P<0.05 or <0.01). In addition, compared with control group, levels of 11β-HSD1 mRNA and protein in visceral adipose tissue of the other three groups were increased significantly, especially in HFD+DEX group (F=32.64-116.00,P<0.01).ConclusionThe combination of dexamethasone and high-fat diet can induce IR in rat successfully, and the expression of 11β-HSD1 mRNA and protein in viseral adipose tissue are increased,which may be closely related to the occurrence of IR.

11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1; Glucocorticoid; Dexamethasone; High-fat diet; Rats

河北省2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(20150432)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.01.004

053000 衡水，哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院藥學(xué)部(孫紅爽，朱小麗，馬紅芳，陳赫軍，種寶貴)，生殖醫(yī)學(xué)科(乜春城)

乜春城，Email:niechuncheng@163.com

FundprogramMedical Scientific Research Project of Hebei Province of China in 2015(20150432)

2015-07-01)