梁雅靈 楊茂君 李衍輝 黎秋晗 黃煒 徐勇

臨床研究

·論著·

尿L-FABP、KIM-1、NGAL和血清cystatin C在糖尿病腎病中的變化及意義

梁雅靈 楊茂君 李衍輝 黎秋晗 黃煒 徐勇

目的探討尿液肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)、腎損傷分子-1(KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin) C水平在糖尿病腎病患者中的改變以及臨床意義。方法納入2011年10月至2012年10月瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科確診為2型糖尿病(T2DM)的住院患者118例，根據(jù)尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)分為正常白蛋白尿組(n=45)、微量白蛋白尿組(n=42)以及大量白蛋白尿組(n=31)。同時選擇同期健康體檢者41名作為正常對照組。采用ELISA法檢測尿L-FABP、KIM-1和NGAL，免疫比濁法檢測血清cystatin C。所有尿液檢測指標經尿肌酐校正，比較各組間各標志物的變化情況及與UACR、估計的腎小球濾過率(eGFR)的相關性。結果與正常對照組相比，糖尿病各組尿L-FABP和血清cystatin C水平明顯升高，(χ2=77.959，104.003，P均<0.05)；尿KIM-1水平亦明顯升高(χ2=29.711，P<0.05)。微量白蛋白尿組與大量白蛋白尿組尿NGAL水平較正常對照組和正常白蛋白尿組明顯升高(χ2=23.833，P<0.05)，但在正常白蛋白尿組與正常對照組間未見明顯變化。尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C與UACR呈正相關(r=0.719，0.427，0.327，0.726，P均<0.01)；僅L-FABP、血清cystatin C與eGFR呈負相關(r=-0.301、-0.791，P<0.01)。結論尿L-FABP、KIM-1、NGAL和血清cystatin C 在糖尿病腎病早期顯著升高，其中尿L-FABP和血清cystatin C可能是反映糖尿病腎損傷較好的生物學指標。

糖尿病腎??；肝型脂肪酸結合蛋白；腎損傷分子-1；中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白；血清cystatin C

糖尿病腎病(DN)的病程呈進行性不可逆發(fā)展，嚴重影響患者的預后和生命，因此早期診斷和治療至關重要。微量白蛋白尿作為早期識別DN最主要的依據(jù)之一，因其檢測時出現(xiàn)較大的變異性以及與腎功能損害進展缺乏一致性，常出現(xiàn)在早期腎損傷之后[1]。因此急切需要尋找能夠預測或診斷早期DN的有效生物學標志物。

尿肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)、腎損傷分子-1(KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)常反映腎小管-間質損傷，是近年來診斷急性腎損傷比較新穎的生物學標志物[2-4]。另外血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)C 因與年齡、性別、肌肉量、飲食、血脂和炎性反應無關，且在小兒及中、老年中均適用，在腎小球早期損害中其敏感性高于血肌酐等其他指標，故已成為反映腎小球濾過率非常穩(wěn)定的指標[5]。

目前，雖然腎損害的早期診斷標志物引起了廣泛關注和研究，但是較少有研究同時關注尿L-FABP、KIM-1、 NGAL和血清cystatin C是否能成為診斷早期DN的重要標志物。故本研究以2型糖尿病患者為研究對象，檢測尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平，觀察其與尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)及估計的腎小球濾過率(eGFR)的相關性，探討其在 DN患者中的改變及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年10月至2012年10月在滬州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科住院治療的118例2型糖尿病患者， 均符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷和分型標準且年齡>40歲。排除標準：(1)泌尿系統(tǒng)疾病，如原發(fā)性腎炎或其他繼發(fā)性腎炎，泌尿系統(tǒng)感染，急、慢性腎功能不全等。(2)合并高血壓、妊娠、惡性腫瘤、外傷、嚴重心功能不全、痛風、自身免疫性疾病、肝病和近期感染等。根據(jù)UACR將糖尿病患者分為3組：正常白蛋白尿組45例，男18例，女27例，平均年齡(59.0±8.4)歲，UACR <30 mg/g；微量白蛋白尿組42例，男17例，女25例，平均年齡(61.9±8.7)歲，UACR 30～300 mg/g；大量白蛋白尿組31例，男15例，女16例，平均年齡(60.1±10.0)歲，UACR>300 mg/g。另選同期健康體檢者41名作為正常對照組，男10名，女31名，平均年齡(58.2±10.2)歲。本研究得到我院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料及標本收集 無菌尿管收集研究對象清潔中段尿液標本5 ml，4 000 r/min(r=13 cm)離心 5 min，存于-80℃冰箱保存待檢。同時空腹抽靜脈血4 ml，分離血清存于-80℃冰箱保存。避免反復凍融。并且收集受試者性別、年齡、身高、體重以及本院中心實驗室所檢測的腎功能、生化等資料。采用中國人改良簡化MRDD方程：eGFR[ml·min-1·(1.73 m2)-1]=186×(血肌酐/88.4)-1.154×年齡-0.203×(中國×1.233)×(女性×0.742)[6]。

1.2.2 試驗方法 運用ELISA試劑盒分別檢測尿液中L-FABP、KIM-1、NGAL濃度，試劑盒分別購自Hycult biotech、R&D systerm、Ray Biotech公司，實驗方法嚴格按試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標本吸光度計算標本相應的L-FABP、KIM-1、NGAL水平。血清cystatin C濃度采用免疫比濁法進行檢測。

2 結果

2.1 各組一般臨床資料及生化指標比較 各組年齡、身高、體重及體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組病程、空腹血糖、餐后血糖、平均血糖、HbA1c水平均明顯高于正常對照組(P均<0.05)。

隨著UACR的增加，血肌酐、尿素氮水平逐漸升高并且在大量白蛋白尿組達最高(P<0.05)。糖尿病各組的血脂水平除甘油三酯外均有所變化，總膽固醇水平在大量白蛋白尿組中較正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組明顯升高(P<0.05)；高密度脂蛋白-膽固醇和低密度脂蛋白-膽固醇水平在正常白蛋白尿組與微量白蛋白尿組中均較正常對照組降低(P<0.05)。另外，糖尿病各組中血清白蛋白隨著UACR增加而降低，并且在大量白蛋白尿組達最低(P<0.05)，而糖尿病各組中的血紅蛋白較正常對照組呈降低趨勢，且在大量白蛋白尿組達最低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平比較 所有尿液檢測指標通過尿肌酐校正后，尿L-FABP和血清cystatin C水平在正常對照組、正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組中呈逐漸上升趨勢，并在大量白蛋白尿組中達最高，且組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；尿KIM-1水平在糖尿病各組中均較正常對照組明顯升高(P<0.05)；另外，尿NGAL水平在微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組中較正常對照組及正常白蛋白尿組明顯升高(P<0.05)，但在正常白蛋白尿組中較正常對照組未見明顯改變，見表2。

2.3 各檢測指標與UACR及eGFR相關性分析 尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平與UACR呈正相關，其中尿L-FABP、血清cystatin C更具有顯著意義(P<0.01)[12]。僅尿L-FABP、血清cystatin C水平與eGFR呈負相關，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表1 4組一般臨床資料及生化指標比較

注：UACR：尿微量白蛋白/肌酐比值；eGFR：估計的腎小球濾過率；與正常對照組相比，aP<0.05；與正常白蛋白尿組相比，bP<0.05；與微量白蛋白尿組相比，cP<0.05

表2 4組各檢測指標水平比較

注：NGAL：中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白；KIM-1：腎損傷分子-1； L-FABP：肝型脂肪酸結合蛋白；cystatin C：半胱氨酸蛋白酶抑制物C；所有尿液檢測指標均經尿肌酐校正，與正常對照組相比，aP<0.05；與正常白蛋白尿組相比，bP<0.05；與微量白蛋白尿組相比，cP<0.05

表3 各檢測指標與UACR、eGFR相關性分析

注：NGAL：中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白；KIM-1：腎損傷分子-1； L-FABP：肝型脂肪酸結合蛋白；cystatin C：半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；UACR：尿微量白蛋白/肌酐比值；eGFR：估計的腎小球濾過率

3 討論

DN早期臨床癥狀并不典型，當出現(xiàn)明顯而持續(xù)的蛋白尿時提示腎損害將不可逆轉，最終可能發(fā)展為腎功能衰竭。因此發(fā)現(xiàn)新的2型糖尿病早期腎臟損傷標志物對患者作出及時診斷和干預治療具有重要意義。

微量白蛋白尿的發(fā)生主要與腎小球早期電荷屏障受損有關，但它易受運動、月經周期、心功能不全等多種因素影響，故對預測DN進展的實用性并不理想。近期許多研究發(fā)現(xiàn)在部分早期DN患者中腎小管損害有時會早于腎小球，所以相對于腎小球標志物，腎小管的標志物可能更加有利于診斷早期DN[7]。

L-FABP是一種主要在肝臟中表達的游離脂肪酸攜帶蛋白，在近端腎小管上皮細胞內也有表達。研究顯示，L-FABP不僅在慢性腎小球腎炎患者中高表達而對腎臟疾病的發(fā)生起預警作用，同時反映了腎小管間質的損傷[8]。另有研究表明在2型糖尿病患者中尿L-FABP水平顯著升高，并與肌酐清除率呈負相關[9]。血清cystatin C是一類可由人體中所有有核細胞產生的蛋白，生長速度穩(wěn)定，不受年齡、性別、肝病、炎性反應等多種因素影響，且腎臟是其唯一的清除途徑[10]。血清cystatin C在腎小管中幾乎100%被重吸收，故其可作為腎功能不全的理想內源性指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，尿L-FABP及血清cystatin C 水平在糖尿病各組中較正常對照組都顯著升高；同時伴隨UACR水平的升高，兩者也逐漸升高，并且在大量白蛋白尿組表達最多；相關性研究顯示，兩者均與UACR呈正相關(r=0.719，0.726，P<0.01)，與eGFR呈負相關(r=-0.301，-0.791，P<0.01)。可見尿L-FABP及血清cystatin C水平不僅在早期DN中顯著升高，而且與腎臟損傷的嚴重程度相一致，有助于監(jiān)測DN的病情發(fā)展。

KIM-1是一種參與腎臟損傷和修復的Ⅰ型跨膜蛋白，在正常腎臟中表達甚微，當腎缺血或中毒性腎損傷時，KIM-1會在發(fā)生纖維化及炎性反應的近端小管的頂膜中高表達[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在健康人群中KIM-1幾乎不表達，但在1型糖尿病患者尿白蛋白正常組及微量白蛋白尿組中均顯著增加[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，尿KIM-1水平在糖尿病各組中較正常對照組顯著升高，并且與UACR呈正相關(r=0.427，P<0.01)，提示在尿白蛋白尚屬正常范圍的情況下，尿KIM-1表達已有明顯升高，因此可認為在早期DN中，尿KIM-1的出現(xiàn)比白蛋白尿要早。

NGAL是由一條小型而較隱秘的多肽鏈組成，其主要表達于近端小管，但也存在于遠側腎單位[13]。正常生理情況下表達甚微，可以保障腎臟發(fā)育,當發(fā)生急性腎損傷時NGAL表達急劇升高，可以增強腎組織內抗炎反應起到保護腎臟的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲佐菌素誘導的DN小鼠模型中，盡管腎臟NGAL基因和蛋白均有所上調，但是因為腎臟重吸收嚴重受損，NGAL被大量排泄于尿液中，因此尿NGAL顯著升高[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)在微量白蛋白尿組及大量白蛋白尿組中，NGAL水平顯著高于正常對照組及正常白蛋白尿組，但后兩者相比無明顯差異；相關性研究中，尿NGAL與UACR呈正相關(r=0.327，P<0.01)，表明雖然尿白蛋白在正常范圍時NGAL表達的改變無明顯意義，但在糖尿病早期仍呈顯著升高趨勢。

綜上所述，尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C具有較好的實用性，在早期DN中的表達顯著升高；尿L-FABP、KIM及血清cystatin C在尿白蛋白尚屬正常范圍內表達便顯著上調，提示三者的出現(xiàn)比白蛋白尿要早；另外，尿L-FABP及血清cystatin C 表達水平與腎臟損傷的嚴重程度相一致，有利于評估DN患者的病情發(fā)展。

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ChangesofurinaryL-FABP,KIM-1,NGALandserumcystatinCindiabeticnephropathyanditsclinicalvalue

LiangYaling,YangMaojun,LiYanhui,LiQiuhan,HuangWei，XuYong.

DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,China

Correspondingauthor：XuYong,Email:xywyll@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the changes of urinary liver-type fatty acid binding protein(L-FABP), kidney injury molecule-1(KIM-1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and serum cystatin C in diabetic nephropathy and its clinical value.MethodsA total of 118 patients diagnosed with type 2 diabetes in the Department of Endocrinology of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University from October 2011 to October 2012 were recruited in this study. According to their urinary albumin-to-creatinine ratio(UACR), patients were divided into normal albuminuria group(n=45), microalbuminuria group(n=42), and macroalbuminuria group(n=43). A total of 41 healthy subjects were enrolled as normal control group(n=41). Enzyme-linked immunosorbent assays were used to measure the levels of urinary L-FABP, KIM-1 and NGAL.Turbidimetric inhibition immuno-assay was used to measure the expression of serum cystatin C. All the urinary indicators were adjusted by the level of urine creatinine. Changes of biomarkers in each group and their crrelations between UACR, eGFR were also compared.ResultsCompared with normal control group, urinary L-FABP and serum cystatin C were significantly increased in diabetic groups (χ2=77.959，104.003，allP<0.05); urinary KIM-1 was also significantly increased (χ2=29.711，P<0.05). Urinary NGAL was increased in microalbuminuria group and macroalbuminuria group compared with normal control group and normal albuminuria group(χ2=23.833,P<0.05), but there were no significant difference between normal albuminuria group and normal control group. Urinary L-FABP, KIM-1, NGAL and serum cystatin C were positively correlated with UACR(r=0.719, 0.427, 0.327, 0.726, allP<0.01); while L-FABP and serum cystatin C were negatively correlated with eGFR(r=-0.301，-0.791, allP<0.01).ConclusionUrinary L-FABP, KIM-1, NGAL and serum cystatin C are increased in early diabetic nephropathy, while urinary L-FABP and serum cystatin C may be the better biomarkers to predict diabetic renal injury.

Diabetic nephropathy;Liver-type fatty acid binding protein; Kidney injury molecule-1; Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; Serum cystatin C

四川省教育廳重點項目(10ZA036)；四川省國際合作項目(14GH0003)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.005

646000 瀘州，四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科

徐勇，Email：xywyll@aliyun.com

FundprogramEducational Commission of Sichuan Province of China(10ZA036); Project of Sichuan International Cooperation(14GH0003)

2016-07-12)