郭明宇，彭詩(shī)博，陳元操，常曉棟，張　茜，陳　萌

（1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系本科2014級(jí)，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院影像本科2014級(jí)；3.指導(dǎo)教師）

學(xué)生園地

Cystatin C對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠LC3的影響*

郭明宇1，彭詩(shī)博2，陳元操1，常曉棟1，張茜1，陳萌3

（1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系本科2014級(jí)，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院影像本科2014級(jí)；3.指導(dǎo)教師）

腦缺血；再灌注損傷；自噬；LC3

中風(fēng)是引起人類死亡和致殘的主要原因之一，其中缺血性中風(fēng)即腦梗死，主要由腦血管閉塞引起。而所有腦血管中，若大腦中動(dòng)脈閉塞常會(huì)導(dǎo)致腦血流量大幅度減少，從而造成谷氨酸興奮、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等一系列神經(jīng)中毒的事件，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，如細(xì)胞凋亡、壞死和自噬［1-3］。自噬不僅參與神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程，還有研究發(fā)現(xiàn)自噬可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用［4］。本研究應(yīng)用Cystatin C干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠，觀察自噬相關(guān)蛋白LC3的變化，研究Cys C對(duì)缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性清潔級(jí)Spague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量260-280g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2藥物與試劑 Cystatin C（Enzo life Sciences，瑞士）；一抗LC3試劑（MBL株式會(huì)社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，日本），β-actin（中杉金橋，北京）；二抗分別為辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（KPL 美國(guó)），辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠（中杉金橋，北京）。

1.3動(dòng)物模型制備 術(shù)前禁食12h，模型組和Cys C組參照Z(yǔ)ea-Longa改良線栓法［5］制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞2h再灌注24h模型。假手術(shù)組僅分離頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不做插線處理。大鼠蘇醒后模型成功標(biāo)志為：右眼出現(xiàn)Horner征、行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，提尾時(shí)左前肢屈曲內(nèi)收。

1.4神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于再灌注24h對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分。無神經(jīng)功能缺損癥狀0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪1分；向外側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；向內(nèi)側(cè)傾倒3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失4分。1-3分留用，0 分、4分者棄去，并及時(shí)補(bǔ)足。

1.5方法 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Cys C組，每組8只。Cys C組于術(shù)前60min鼠尾靜脈注射Cys C（5mg/L），假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。

麻醉后將各組大鼠迅速處死，采用Western Blot法檢測(cè)損傷腦皮質(zhì)組織中LC3蛋白表達(dá)。模型組和Cys C組取缺血再灌注損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織，假手術(shù)組取同側(cè)對(duì)應(yīng)部位新鮮腦皮質(zhì)組織，3組均加入裂解液后提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍咨蠘?，聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液室溫封閉，分別加入一抗兔抗LC3（1：1000）、小鼠抗β-actin（1：500），4℃孵育過夜。洗膜后分別加入二抗（HRP）結(jié)合的羊抗兔（1：5000）和羊抗小鼠（1：2000）孵育；洗膜，超敏發(fā)光液（ECL）顯色劑發(fā)光，膠片曝光顯影。Quantity One 4.62軟件分析條帶的平均灰度值，以目的條帶與對(duì)應(yīng)β-actin條帶灰度值之比作為L(zhǎng)C3蛋白表達(dá)量的相對(duì)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為2.43±0.51；Cys C組神經(jīng)功能缺損評(píng)分1.80±0.52，較模型組評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。

2.2腦組織大體標(biāo)本觀察 假手術(shù)組無明顯變化，模型組腦組織大體標(biāo)本可見右側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯水腫，體積增大；與模型組相比，Cys C組腦組織水腫有所改善。

2.3Western Blot結(jié)果 假手術(shù)組腦組織LC3蛋白表達(dá)為0.609±0.077，模型組損傷側(cè)腦組織LC3蛋白表達(dá)水平為0.811±0.035，較假手術(shù)組有所增高；而Cys C組LC3表達(dá)1.01±0.378，較模型組和假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）。見附圖：

附圖　各組大鼠腦組織中LC3蛋白的表達(dá)水平

3　討論

缺血性腦血管病在治療過程中容易發(fā)生缺血再灌注損傷，損傷后細(xì)胞程序性死亡會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及自噬等細(xì)胞死亡形式。自噬是通過自身形成的自噬囊泡，吞噬胞漿內(nèi)變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，通過微管相關(guān)蛋白，以動(dòng)力依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解的過程［6］。它有別于壞死，也不同于凋亡。適度激活自噬可能在受損細(xì)胞中幫助清除受損的細(xì)胞器和異常蛋白、防止蛋白聚集，對(duì)細(xì)胞損傷起保護(hù)作用［7］。

LC3系統(tǒng)主要參與自噬泡的修飾，LC3蛋白的表達(dá)水平是自噬檢測(cè)的敏感指標(biāo)［8］。正常情況下LC3-Ⅰ主要存在于胞漿中，在自噬發(fā)生過程中，微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-II，參與自噬體的形成。LC3-II是自噬體的標(biāo)志分子，其含量多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。因此，通過檢測(cè)LC3-II可反映自噬活性［9］。

Cystatin C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有非常重要的關(guān)系。Cys C具有抗淀粉樣蛋白生成作用，有研究表明遲發(fā)性阿爾茨海默病（AD）與Cys C的基因連鎖相關(guān)。Tizon［11］等［10］研究表明神經(jīng)元在營(yíng)養(yǎng)匱乏、秋水仙素、氧化應(yīng)激等細(xì)胞毒性環(huán)境中Cystatin C對(duì)其具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用不是Cys C抑制組織蛋白酶B實(shí)現(xiàn)，而是Cys C通過mTOR途徑誘導(dǎo)功能性自噬實(shí)現(xiàn)的；如果抑制自噬，Cys C的神經(jīng)保護(hù)作用就會(huì)被阻止。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Cystatin C可作為一種新的自噬誘導(dǎo)劑，通過誘導(dǎo)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦皮層的自噬可能對(duì)早期腦損傷起到保護(hù)作用［12］。此外，外源性的Cys C能夠保護(hù)神經(jīng)元避免β淀粉樣蛋白（Aβ）毒性誘導(dǎo)的死亡［13］。因此通過調(diào)節(jié)Cys C的表達(dá)有望成為治療中風(fēng)、AD和其它神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：x與假手術(shù)組相比，模型組LC3蛋白表達(dá)增多，Cystatin C干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠后，腦皮質(zhì)中LC3表達(dá)持續(xù)增高，自噬作用增強(qiáng)。但對(duì)于Cystatin C在缺血再灌注損傷中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚，其在自噬與缺血再灌注損傷中的確切機(jī)制和涉及的調(diào)控因子，還需更多的實(shí)驗(yàn)研究來闡明。

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（學(xué)生園地欄目編輯：張 健）

R332

A

1004-6879（2016）01-079-02

2015-10-10）

* 河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2015406046）