李 京，張祥林，王 翀，李亞偉，張小菊

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆出入境檢驗檢疫局，烏魯木齊 830063)

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基于線粒體DNAcox2基因的甜菜霜霉病的分子檢測技術(shù)

李 京1,2，張祥林2，王 翀2，李亞偉2，張小菊2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆出入境檢驗檢疫局，烏魯木齊 830063)

【目的】建立甜菜霜霉病菌檢測技術(shù)?！痉椒ā坷玫任换蛱禺愋訮CR(AS-PCR)的原理，依據(jù)線粒體DNA(mtDNA)基因cytochrome c oxidase subunit II(cox2),運(yùn)用卵菌門通用引物 (P-COX2F /P-COX2R) 擴(kuò)增甜菜霜霉病菌及6種對照霜霉病菌的目的片段，測序，比對，根據(jù)等位基因特異PCR(AS-PCR)原理設(shè)計測甜菜霜霉病菌的特異性引物，并對該引物的特異性、靈敏度加以驗證；分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。【結(jié)果】通用引物擴(kuò)增的甜菜霜霉病菌以及其他霜霉病菌片段大小約為630 bp，經(jīng)比對，該霜霉病菌與Peronosporaschachtii同源性達(dá)99%，并設(shè)計出特異性引物BSP-F/BSP-R，特異性引物BSP-F/BSP-R可以檢測到10-2ng/μL的模板濃度?！窘Y(jié)論】建立的甜菜霜霉病菌快速檢測技術(shù),為口岸的進(jìn)出境監(jiān)測與檢測提供了科學(xué)依據(jù)。

甜菜霜霉病；mtDNA；特異性引物；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

0 引 言

【研究意義】霜霉病是較為重要的卵菌門植物病害之一，對許多農(nóng)作物造成了較為嚴(yán)重的損失。霜霉病是危害甜菜的毀滅性病害之一,2007年被列為我國進(jìn)境植物檢疫性危險性有害生物。甜菜霜霉病19世紀(jì)末始于法國,后來在俄羅斯、美國等國家大面積爆發(fā)，并造成了較為嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。20世紀(jì)60至90年代在我國貴州、四川以及新疆伊犁州發(fā)生此病，造成了一定程度的減產(chǎn)[2]。甜菜在感染霜霉病后，葉片由淡綠色變成淡黃色，且葉片變色部位背面有灰色霉層出現(xiàn)。大多數(shù)情況下，霉層出現(xiàn)在葉片背面，但當(dāng)環(huán)境濕度足夠的情況下，葉片正面也會有霉層出現(xiàn)[3]。【前人研究進(jìn)展】盡管ITS區(qū)一直被看作是霜霉病最常用的分類方法[4]，但由于ITS區(qū)高度保守性，且種間差異較小，不能自動鑒定它們的基因同源性[5]，同時近年來對于mtDNA 檢測霜霉病的報道越來越多，2000年Deborah S. S. Hudspeth等[6]根據(jù)擴(kuò)增cox2 的序列成功的推斷出15種霜霉菌與前毛絲壺菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；2003年Hudspeth等[7]根據(jù)cox2 分析了霜霉病與白粉病間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；2007年Markus G?ker[8]通過對多個基因(LSU、cox2 、β-Tubulin、NADH)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究來分析各種霜霉病。2011年Robideau GP[9]提出在同種條件下，線粒體中細(xì)胞色素C氧化亞基1(cox1)與內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)相對比，結(jié)果表明cox1是一種比較實(shí)用的方法。在有些情況下cox1比ITS更能區(qū)分種間水平上的差異，然而，大亞基(LSU)卻很難區(qū)分一些親緣關(guān)系較近的種;2011年Young-Joon Choi等[10]依據(jù)兩部分線粒體基因cox2 、nad1的系統(tǒng)發(fā)育來揭示菠菜霜霉病菌(Peronosporaeffusa)的種內(nèi)變異情況；2013年Anna L.Testen 等[11]根據(jù)擴(kuò)增藜麥種子的ITS 與mtDNA基因cox2 的基因序列，同時分析不同品種藜麥種子間的遺傳變異以及與卵菌門其他病原物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，顯示基于cox2 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與ITS的分析結(jié)果大致相同，實(shí)驗證明cox2 也可以作為除ITS以外的另一種分類方法；2015年Young-Joon Choi等[12]經(jīng)研究提出了相比cox1，cox2對物種的鑒定成功率更高，并且，對于比較珍貴的標(biāo)本采用cox2存在更高效率的PCR、測序反應(yīng)[13]，同時，對于一些具有歷史意義的原始標(biāo)本有cox2的相關(guān)序列，但不存在cox1的序列。等位基因特異性PCR(AS-PCR) 是由Newton等1989提出[14]，當(dāng)引物3’末端堿基與等位基因不互補(bǔ)時，PCR擴(kuò)增將不能進(jìn)行，通過單個核苷酸的多態(tài)性來達(dá)到檢測效果，但在有些情況下即便3’堿基不相匹配，擴(kuò)增也能進(jìn)行[15-16]，因此為了增加引物的特異性,人為的在3’末端第二、三的位置引入錯配堿基[17-19]。2014年 Steven J. Klosterman[20]通過AS-PCR的方法成功將菠菜霜霉病菌與甜菜霜霉病菌區(qū)分開。【本研究切入點(diǎn)】目前對于甜菜霜霉病菌的分子檢測技術(shù)相關(guān)報道較少，研究基于線粒體DNAcox2基因的甜菜霜霉病菌的分子檢測技術(shù)及常見霜霉病病原系統(tǒng)發(fā)育分析，建立線粒甜菜霜霉病菌檢測技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以線粒體的cox2基因為靶基因，采用AS-PCR的方法建立甜菜霜霉病菌的分子檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品為甜菜霜霉病葉，均采自伊犁州尼勒克縣；其他供試樣品為杖藜霜霉病葉、雜配藜霜霉病葉、葡萄霜霉病葉(采自于尼勒克縣、五家渠市)，菠菜霜霉病葉(烏魯木齊市三坪農(nóng)場)，萵苣霜霉病葉(采自于烏魯木齊市)，將實(shí)驗樣品進(jìn)行顯微鏡觀察與拍照。表1

表1 .供試霜霉病病原、寄主和來源
Table 1 Downy mildew pathogens,hosts and their sources of this study

序號分類地位寄主來源SequencenoClassificationstatusHostSource1Peronosporaschachtii甜菜Betavulgaris伊犁州尼勒克縣2Peffuse菠菜Spinaciaoleracea烏魯木齊市三坪農(nóng)場3Pvariabilis杖藜Chenopodiumgiganteum伊犁州尼勒克縣4Pfarinosafspchenopodii雜配藜Chenopodiumhybridum伊犁州尼勒克縣5Plasmoparaviticola葡萄Vitisvinifera五家渠市、伊犁州尼勒克縣6Plangustiterminalis蒼耳Xanthiumstrumarium伊犁州尼勒克縣7Bremialactucae萵苣Lactucasativa烏魯木齊市

1.2 方 法

1.2.1 樣品DNA提取

在無菌操作條件下，將甜菜霜霉病葉患病部位連帶葉片一起切下，液氮充分研磨，再用試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)提取甜菜霜霉病菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA擴(kuò)增

采用卵菌門通用引物P-cox2F/P-COX2R[21]擴(kuò)增供試樣品線粒體基因cox2的序列如下：

P-COX2F ：5'-GGCAAATGGGTTTTCAAGATCC-3'

P-COX2R ：5'-CCATGATTAATACCACAAATTTCACTAC-3'

PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，10 μM上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：96℃, 4 min; 96℃, 30 s; 50℃, 30 s; 72℃，1 min共30個循環(huán),；72℃，4 min。將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，100 V電壓條件下電泳35 min，置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外照射觀察并分析。

1.2.3 測序、同源性

在紫外照射儀下，用刀片切下含目的DNA的膠塊，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒膠回收目的片段，送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTN比對，檢測mtDNA的基因鑒定結(jié)果。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育

將甜菜霜霉病菌測序得到的基因序列、其他6種對照霜霉病病原物基因序列以及Genbank數(shù)據(jù)庫下載的，與所測甜菜霜霉病菌同源性較高的病原物的mtDNA基因cox2序列進(jìn)行編輯，運(yùn)用clustalW 軟件[22-23]進(jìn)行序列的整合，最后用Meg5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-joining tree)。

1.2.5 設(shè)計特異性引物與合成

將甜菜霜霉病菌及其他6種對照霜霉病菌的基因序列上傳到Genbank所得到的序列號，并從Genbank數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)布與甜菜霜霉病菌同源性較高的其他mtDNA基因cox2序列，用DNAMAN8.0及GENEDOC進(jìn)行比對分析選取基因cox2的保守區(qū)，根據(jù)AS-PCR的原理，對甜菜霜霉病病原物序列第279位點(diǎn)堿基與其他對照組及同源性較高病原物的該位置的堿基的不同，采用Primer Permier 5.0軟件設(shè)計了一對引物BSP-F/BSP-R，送至生物技術(shù)公司合成。表2

表2 霜霉目種類、寄主、來源、序列號
Table 2 List of organisms,hosts,sources and sequences genbank accession number

病原物寄主來源序列號OrganismHostOrigon GenbankaccessionnoPeronosporaschachtii?甜菜Betavulgaris本項研究KT944079Pfarinosafspbeta甜菜BetavulgarisGenbankFJ649394Pschachtii甜菜BetavulgarisGenbankKP3306161Pschachtii甜菜BetavulgarisGenbankKP3306061Peffuse?菠菜Spinaciaoleracea本項研究KT944073Pvariabilis?杖藜Chenopodiumgiganteum本項研究KT944074Pfarinosafspchenopodii?雜配藜Chenopodiumhybridum本項研究KT944076Plepigoni牛漆姑草屬SpergulariarubraGenbankKP3306611Pobovata牛漆姑草屬SpergulaarvensisGenbankKP3306511Ppolycarpi多莢草屬PolycarpondiphyllumGenbankKP3306201Prumicis酸模屬RumexacetosellaGenbankKP3306341Psp2709酸模屬RumexarifoliusGenbankKP3306351PspHV2657酸模屬RumexacetosaGenbankKP3306301Psp1164牛漆姑草屬SpergulariamarinaGenbankKP3306551Plasmoparaangustiterminalis?蒼耳Xanthiumstrumarium本項研究KT944075Plviticola?葡萄Vitisvinifera本項研究KT944077Bremialactucae?萵苣Lactucasativa本項研究KT944078

注：符號(*)的病原物為實(shí)驗所采集到的病葉提取得到的，其中這些病原物的序列也已經(jīng)上傳到Genbank并獲得了序列號，其余未標(biāo)注的病原物信息為Genbank下載

Note: Signals (*) were used to label the organisms which were obtained from infected leaves in this study,the sequences of these organisms were submitted to genbank and obtained accession numbers,non-signals were downloaded from NCBI

1.2.6 巢式PCR檢測

首先用引物P-COX2F/ P-COX2R進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后用特異性引物BSP-F/BSP-R進(jìn)行第二輪擴(kuò)增(將第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增的模板)。第一輪擴(kuò)增程序同上，第二輪擴(kuò)增程序：94℃，5 min；94℃，30 s；53℃，30 s；72℃，1 min循環(huán)38次；72℃，10 min。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，10 μM上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，模板2 μL，總體積25 μL。

1.2.7 特異性引物靈敏度檢測

將提取的甜菜霜霉病菌的模板DNA進(jìn)行倍比稀釋，共設(shè)置7個濃度梯度分別是：10-3ng/μL、10-2ng/ μL、10-1ng/μL、1 ng/μL、10 ng/μL、20 ng/μL、40 ng/μL，然后用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，查看該引物能檢測到的最低模板濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

經(jīng)顯微鏡觀察，甜菜霜霉菌(圖1：A、B、C)、菠菜霜霉菌(圖1D)、藜霜霉菌(圖1：E、F)的孢囊梗形態(tài)較為接近，但前兩者是屬于主干單軸分支，后者為明顯的二叉狀分支，且前兩者的孢囊梗比較直或者稍微有點(diǎn)弧度，后者的孢囊梗是整個平滑彎曲。在7種孢囊梗中，甜菜霜霉病菌與菠菜霜霉病菌的形態(tài)最為接近，但在孢囊梗分支的末端，甜菜霜霉菌孢囊梗末端錐形，不尖銳；菠菜霜霉病菌孢囊梗末端很尖銳；萵苣霜霉病孢囊梗(圖1I)末端為盤狀；葡萄霜霉病菌(圖1H)與蒼耳霜霉病菌(圖1G)二者的孢囊梗單軸直角分支。因此，甜菜霜霉病菌孢囊梗為單軸二叉狀分支，銳角或直角分支3～8次，末端分支(21～30 μm)× (17.5～22.5 μm)。圖1

注：A～B:甜菜霜霉病菌的孢囊梗；C:甜菜霜霉病菌的孢子囊；D～I(xiàn)：各霜霉病菌的孢囊梗，它們的寄主分別是:菠菜、杖藜、雜配藜、蒼耳、葡萄、萵苣

Note：A-B:Sporangiophores of sugar beet downy mildew pathogen;C:sporangia of sugar beet downy mildew pathogen;D-I:sporangiophores of downy mildew pathogens that the hosts of these areSpinaciaoleracea、Chenopodiumgiganteum、Chenopodiumhybridum、Xanthiumstrumarium.、Vitisvinifera、Lactucasativa

圖1 甜菜霜霉病菌與其他對照樣品的鏡檢形態(tài)
Fig.1 The morphology of sugar beet downy mildew pathogen and other controls group of oomycota through microscopy(This figure obtained from this study)

2.2 通用引物P-COX2F/ P-COX2R的擴(kuò)增及測序結(jié)果

采用卵菌門通用引物P-COX2F/ P-COX2R擴(kuò)增甜菜霜霉病菌及其他供試霜霉病菌(菠菜霜霉病菌、杖藜霜霉病菌、雜配藜霜霉病菌、蒼耳霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、萵苣霜霉病菌)線粒體(mtDNA)基因cox2的基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，結(jié)果顯示：甜菜霜霉病葉、杖藜霜霉病葉、蒼耳霜霉病葉、雜配藜霜霉病葉、葡萄霜霉病葉、菠菜霜霉病葉、萵苣霜霉病葉均能擴(kuò)增出大小約為630 bp左右的DNA片段。 圖2

注：M：2 000 bp DNA Ladder；1～7：甜菜霜霉病菌、杖藜霜霉病菌、蒼耳霜霉病菌、雜配藜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、萵苣霜霉病菌；8：空白對照

Note：M:2，000 bp DNA Ladder;1-2:downy mildew pathogens ofBetavulgaris;3-7:downy mildew pathogensChenopodiumgiganteum、Xanthiumstrumarium、Chenopodiumhybridum、Vitisvinifera、Spinaciaoleracea、Lactucasativa;9:Blank

圖2 引物P-COX2F/ P-COX2R的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 The PCR amplified result by primer P-COX2F/ P-COX2R

2.3 測序及同源性

測序結(jié)果顯示，甜菜霜霉病的片段大小為631 bp，將測序結(jié)果逐一在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，比對結(jié)果顯示：甜菜霜霉病菌與Peronosporaschachtii同源性最高達(dá)100%，因此可認(rèn)為該甜菜霜霉病菌屬于P.schachtii。其他供試材料比對結(jié)果：其片段大小與甜菜霜霉病菌的片段大小相差不大，均為630 bp左右，其中菠菜霜霉病屬于P.effuse；杖藜霜霉病菌屬于P.variabilis；雜配藜霜霉病菌屬于P.farinosaf.sp.chenopodii；蒼耳霜霉病菌屬于Plasmoparaangustiterminalis；葡萄霜霉病菌屬于Pl.viticola；萵苣霜霉病菌屬于Bremialactucae。將7種供試材料的cox2的基因序列上傳至Genbank，獲得7個序列號分別是：KT944079(Peronospora.schachtii)；KT944073(Peronospora.Effuse)；KT944074(Peronospora.Variabilis)；KT944075(Plasmoparaangustiterminalis)；KT944076(Peronospora.farinosaf.sp.chenopodii)；KT944077(Plasmopara.viticola)；KT944078(Bremialactucae)。表2，圖3

圖 3 引物P-COX2F/ P-COX2R測得的序列
Fig.3 Sequence of polymorphic fragment P.schachtii amplified by primers P-COX2F/ P-COX2R

2.4 系統(tǒng)發(fā)育

測序得到甜菜霜霉病菌(P.schachtii)mtDNA基因cox2的基因序列。根據(jù)測序得到的P.schachtii和6種對照樣品的基因序列以及從Genbank數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)序列，運(yùn)用分支進(jìn)化學(xué)法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化分析，其中甜菜霜霉病菌序列：P.schachtii(KT944079)與P.farinosaf.sp.beta(FJ649394)、P.schachtii(KP330616.1)、P.schachtii(KP330606.1)包含在了一個分支單元組內(nèi)，在Neighbor-joining tree中驗證可信度值93%，但這些序列與寄主為杖藜、牛漆姑草屬、雜配藜、蒼耳、葡萄、萵苣的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，同時，該系統(tǒng)發(fā)育樹也揭示了P.schachtii與P.effuse、P.rumicis、P.sp. 2709、P.sp. HV2657(后兩者的寄主為酸模屬)形成了一個較大的分支，可信度值為82%。圖4

2.5 常規(guī)PCR特異性引物的設(shè)計

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫下載同源性較高的序列以及該試驗測序獲得的甜菜霜霉病菌及其他6種對照霜霉病的mtDNA基因cox2的序列，按照表2從上到下的順序進(jìn)行序列比對，(圖5)其中，根據(jù)甜菜霜霉病P.schachtii(KT944079)與其他霜霉病菌第279位點(diǎn)(TC)等位基因的不同，但該位點(diǎn)與Genbank數(shù)據(jù)庫下載的其他三個甜菜霜霉病基因序列相同，因此根據(jù)等位基因位點(diǎn)設(shè)計特異性引物BSP-F/ BSP-R，序列為(加粗堿基為SNP位點(diǎn))圖5：

BSP-F：5'-CAATGGATGAAGTAATTGAC -3'

BSP-R：5'-GGTTCATCTGAAAACTCTAA-3'

注：分支顯示的數(shù)字是經(jīng)過1 000 bootstap replicates得到的，且bootstap值均大于60 % ，符號(*)表示研究獲得的樣品,實(shí)心黑的三角形(▲)表示研究獲得的的P.schachtii,對照樣品用空心三角形(△)標(biāo)注

Note：Numbers of the branches represent bootstap values above 60 % obtained from 1，000 bootstap replicates.Signal (*) denote sequences obtained from this study .TheP.schachtiiof this study is shown witha solid black triangle(▲),other control groups of this study is shown with hollow triangle(△)

圖4 基于線粒體cox2的甜菜霜霉病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.4 Phylogenetic tree of P.schachtii based on the mt DNA gene cox2

2.6 巢式PCR及特異性檢測

巢式PCR電泳結(jié)果為，第一步卵菌門通用引物P-COX2F/ P-COX2R能將所有的供試材料擴(kuò)增出來，片段大小均為630 bp左右。第二步用實(shí)驗設(shè)計的特異性引物BSP-F/BSP-R來擴(kuò)增第一步得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，僅甜菜霜霉病菌出現(xiàn)條帶，片段大小為103 bp。圖6

注：方框核酸顯示了設(shè)計的P.schachtii特異性引物(BSP-F/ BSP-R)的具體位置(垂直向下的箭頭指示的是SNP位點(diǎn)的位置，符號(**)標(biāo)注的序列號為實(shí)驗獲得 )

Note：The nucletides delimited in boxes indicate locations of designed specific primers (BSP-F/ BSP-R) ofP.schachtii(the vertical arrow showed the position of the SNP ),the double asterisks (**) behind the genbank accession number denotes the P.schachtii sequence number of this study

圖5 設(shè)計的特異性引物(BSP-F/ BSP-R)具體位置
Fig.5 The lacations of designed specific primers (BSP-F/ BSP-R)

注：M:2 000 bp DNA Ladder；1：空白對照；2～3：甜菜霜霉病菌；4～9：杖藜霜霉病菌、蒼耳霜霉病菌、雜配藜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、萵苣霜霉病菌

Note：M:2，000 bp DNA Ladder;1:Blank;2-3:downy mildew pathogens ofBetavulgaris;4-9:downy mildew pathogensChenopodiumgiganteum、Xanthiumstrumarium、Chenopodiumhybridum、Vitisvinifera、Spinaciaoleracea、Lactucasativa

圖 6 特異性引物BSP-F/BSP-R擴(kuò)增結(jié)果
Fig.6 The PCR amplified result by primer BSP-F/BSP-R

2.7 特異性引物靈敏度檢測

將甜菜霜霉病菌的DNA進(jìn)行倍比稀釋,濃度分別為：10-3、10-2、10-1、1、10、20和40 ng/μL，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示：當(dāng)隨著甜菜霜霉病菌模板濃度的較低，電泳條帶越來越暗，當(dāng)模板濃度為10-3ng/μL時電泳圖上無條帶出現(xiàn)，實(shí)驗結(jié)果顯示該特異性引物能檢測到10-2ng/μL的模板濃度。圖7

注：M:2 000 bp DNA Ladder;1-8:10-3、10-2、10-1、1 、10 、20 、40 和100 ng/μL;9:空白對照

Note：M:2，000 bp DNA Ladder;1-8:10-3ng/μL、10-2ng/μL、10-1ng/μL、1 ng/μL、10 ng/μL、20 ng/μL、40 ng/μL、100 ng/μL;9:blank

圖7 特異性引物BSP-F/BSP-R靈敏度檢測結(jié)果
Fig.7 The result of sensitivity detection amplified by specific primer BSP-F/BSP-R

3 討 論

研究供試樣品DNA提取方法采用了霜霉病葉直接提取法，雖然此方法在提取霜霉病菌的同時也提取了感染霜霉病葉片的DNA，但采用了常規(guī)PCR采用了巢式PCR法，該方法第一輪擴(kuò)增采用了卵菌綱線粒體cox2基因通用引物，該引物只能擴(kuò)增出霜霉病菌，第二輪采用甜菜霜霉病菌特異性引物，進(jìn)一步將甜菜霜霉病菌擴(kuò)增出來，因此經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物內(nèi)只能將霜霉病菌擴(kuò)增出來，不用擔(dān)心寄主DNA對實(shí)驗結(jié)果的影響。

在實(shí)驗過程中，開始僅僅根據(jù)等位基因第279位點(diǎn)的不同設(shè)計了一對引物，但經(jīng)實(shí)驗驗證，該引物不僅僅擴(kuò)增出了甜菜霜霉病菌，也將菠菜霜霉病菌擴(kuò)增出來，因此為了設(shè)計出一對只針對甜菜霜霉病菌特異性引物根據(jù)在甜菜霜霉病菌在第279位點(diǎn)(TC)的不同設(shè)計了上游引物，然后根據(jù)菠菜霜霉病菌與甜菜及其他霜霉病菌第343位點(diǎn)(TC)的不同設(shè)計了下游引物。經(jīng)實(shí)驗鑒定該引物(BSP-F/ BSP-R)特異性較好，僅能將甜菜霜霉病菌擴(kuò)增出來。

盡管實(shí)驗設(shè)計出甜菜特異性引物BSP-F/ BSP-R，但不能證明該引物不能擴(kuò)增出其他霜霉病菌。因此，實(shí)驗過程中針對該引物特異性進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證分析，以幾種常見霜霉病為例：黃瓜霜霉病(Pseudoperonosporacubensis)、向日葵霜霉病(Plasmoparahalstedii)、大豆霜霉病(Peronosporamanshurica)為例。甜菜霜霉病菌第279位點(diǎn)為(TC)，黃瓜霜霉病菌為(TT)、大豆霜霉病菌(TT)、向日葵霜霉病菌(TC)，初步可以認(rèn)為該引物(BSP-F/ BSP-R)檢測不到黃瓜霜霉病菌以及大豆霜霉病菌，但該引物能檢測到向日葵霜霉病菌。因此，相對而言，不排除甜菜特異性引物BSP-F/ BSP-R存在特異性不高的可能性。

4 結(jié) 論

采用等位基因特異性PCR的原理，建立了快速檢測甜菜霜霉病菌的常規(guī)PCR方法，并且對常見霜霉菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析，其中甜菜霜霉病快速分子檢測技術(shù)，為快速監(jiān)測甜菜上霜霉病菌的發(fā)生與預(yù)防提供了指導(dǎo)方法并為口岸快速檢測甜菜霜霉病菌提供了技術(shù)支持。

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Fund project:Supported by The scientific research project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (201310091) and Xinjiang Agriculture University research joint graduate training program ( xjaucxy-yjs-20131023)

Molecular Detecting Technology of Sugar Beet Downy Mildew Baswd on Mitochondrial DNA Genecox2

LI Jing1,2，ZHANG Xiang-lin2，WANG Chong2，LI Ya-wei2，ZHANG Xiao-ju2

(1. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;2.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi 830063, China )

【Objective】 The purpose of this research is to establish detection technology of sugar beet downy mildew pathogen.【Method】According to cytochrome oxidase subunit II(cox2)of mitochondrial DNA (mtDNA) gene, this study used universal primers (P-COX2F/P-COX2R) of oomycota to amplify the target fragments of sugar beet downy mildew pathogen and other six control groups, sequencing, blastn, then designed specific primers to detect beet downy mildew pathogen based on the principle of allele specific PCR (AS-PCR), verify its specificity and sensitivity, then analyzed their homology and constructed phylogenetic tree, and finally infected healthy sugar beets using inoculum ofP.Schachtiiwhich was to verify whether theP.Schachtiiwas pathogenic.【Result】The experimental results showed that the fragments of sugar beet downy mildew pathogen and others downy mildew pathogens were about 630 bp using oomycota universal primers, the homology of sugar beet downy mildew pathogen of this study were 99% with those downloaded from Genbank and designed a specific primer BSP-F/BSP-R which just amplified beet downy mildew. This primer could detect 10-2ng/μL of template DNA.【Conclusion】A rapid detection ofPeronosporaschachtiihas been extablished, which provided an important scientific basis for monitoring and detecting for the port entry and exit.

sugar beet downy mildew; mtDNA; specific primer; phylogenetic

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.05.011

2016-01-08

國家質(zhì)檢總局科研項目(201310091)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生項目(xjaucxy-yjs-20131023)

李京(1990-)，女，山東人，碩士研究生，研究方向為植物檢疫病害,(E-mail)13579981032@163.com

張祥林(1964-)，男，新疆人，研究員，研究方向為分子植物病理學(xué),(E-mail)XL6479@163.com

S435.121.42

A

1001-4330(2016)05-0857-09