柯孟婷 孫家忠 李揚

·論著·

3,5-二碘-L-甲狀腺素對白色脂肪棕色化的作用

柯孟婷 孫家忠 李揚

目的探究3,5-二碘-L-甲狀腺素(T2)誘導(dǎo)白色脂肪棕色化的作用。方法3T3-L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化并用油紅O染色進行鑒定；細胞分化過程中予不同濃度梯度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)的T2處理，待細胞分化成熟后，分別用實時熒光定量PCR、Western印跡檢測解耦聯(lián)蛋白-1(UCP-1)表達水平的變化；僅予高濃度(100 nmol/L)T2處理， Western印跡法檢測其他棕色脂肪功能性基因，包括誘導(dǎo)細胞死亡DNA片段化因子α樣效應(yīng)因子A(CIDEA)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α(PGC-1α)蛋白表達變化。結(jié)果3T3-L1脂肪前體細胞呈成纖維細胞樣形態(tài)，胞漿中無脂滴；誘導(dǎo)分化成熟后光鏡下油紅O染色可見細胞內(nèi)大量環(huán)狀脂滴。在細胞分化過程中予不同濃度T2干預(yù)后，分化成熟的脂肪細胞上UCP-1 mRNA水平均有升高(t=3.97、11.77、17.7，P均lt;0.05)，蛋白表達水平也均有改變(t=13.31、14.55、23.62，P均lt;0.05)，且在高濃度(100 nmol/L)下最明顯。在高濃度T2(100 nmol/L)干預(yù)下，成熟脂肪細胞的棕色脂肪其他功能性基因蛋白CIDEA、PGC-1α水平表達增加(t=15.92、17.36，P均lt;0.05)。結(jié)論T2可誘導(dǎo)由3T3-L1脂肪前體細胞分化而來的成熟白色脂肪細胞表達棕色脂肪功能性基因。

3T3-L1脂肪前體細胞；白色脂肪棕色化；3,5-二碘-L-甲狀腺素；肥胖癥

棕色脂肪組織是哺乳動物體內(nèi)非顫栗產(chǎn)熱的主要來源，對于維持動物的體溫和能量平衡起重要作用,如今成人亦具有有功能的棕色脂肪組織的觀點已逐漸被接受，棕色脂肪組織燃燒脂肪產(chǎn)生熱量的能力成為人類對抗肥胖以及相關(guān)代謝紊亂疾病的新希望[1]。甲狀腺激素可以通過控制能量儲存與消耗的平衡來調(diào)節(jié)代謝過程[2]。近年發(fā)現(xiàn)，除目前眾所周知的T3以外，3,5-二碘-L-甲狀腺素(T2)亦具有生物活性，它是一種T3脫碘形成的天然代謝產(chǎn)物[3]。T2作為生物活性甲狀腺激素衍生物能夠影響能量代謝，減輕體重以及高脂飲食誘導(dǎo)的相關(guān)代謝疾病[4-5]。其機制可能與其激動棕色脂肪組織，誘導(dǎo)白色脂肪棕色化，增加產(chǎn)熱有關(guān)。T2可以激動棕色脂肪組織已得到研究證明，但是誘導(dǎo)白色脂肪棕色化研究較少[6]。所以本實驗致力于研究T2是否可以誘導(dǎo)白色脂肪棕色化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 3T3-L1脂肪前體細胞購自北京協(xié)和細胞庫， 胎牛血清購自美國Gbico公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，T2、地塞米松、異丁基-甲基-黃嘌呤(IBMX)、油紅O購自美國Sigma公司，胰島素購自北京天威公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生工試劑有限公司。羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗、蛋白抽提試劑盒、喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒生產(chǎn)商Aspen，目錄號AS-1107、AS1001、AS1086；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參抗體生產(chǎn)商abcam，目錄號ab37168；Aspen，化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒生產(chǎn)商Millipore，目錄號WBKLS0500；解耦聯(lián)蛋白(UCP)-1 引物序列由上海生工試劑有限公司設(shè)計和合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪細胞的誘導(dǎo)分化及油紅O染色 將3T3-L1脂肪前體細胞接種在6孔板中，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至完全融合2 d后開始誘導(dǎo)分化：含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，之后用含有10 mg/L胰島素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，以后每48 h換液1次。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測不同濃度藥物處理后，成熟脂肪細胞UCP-1 mRNA表達變化 按上述誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)3T3-L1脂肪前體細胞分化成熟。其中在誘導(dǎo)3T3-L1細胞分化過程中的第3天予不同濃度T2(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L) 處理96 h。細胞分化成熟后用Trizol提取各孔細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR：引物由上海生工試劑有限公司設(shè)計并合成，序列如表1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s；58℃ 20 s；72℃ 20 s，反應(yīng)40個循環(huán)。對PCR反應(yīng)過程中每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強度進行實時檢測和測定各孔樣品的循環(huán)閾值(Ct),以肌動蛋白(actin)為內(nèi)參照，并采用2-ΔΔCT法對目的基因進行相對定量。

表1 實時定量PCR基因引物序列

注：UCP-1：解耦聯(lián)蛋白-1；Actin：肌動蛋白

1.2.3 Western印跡法檢測不同藥物處理后，成熟脂肪細胞UCP-1蛋白水平變化 細胞準(zhǔn)備同上，吸出每孔細胞培養(yǎng)液后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，再加入含苯甲基磺酰氟的細胞裂解液冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度，取樣品40 μg以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流電轉(zhuǎn)膜60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上；經(jīng)洗滌緩沖液配置的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入1∶500稀釋的兔抗人一抗4℃孵育過夜；TBST洗滌后用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)室溫?fù)u床反應(yīng)1 h；洗膜后發(fā)光顯像，并以GAPDH作為內(nèi)參，用AlphaEaseFC軟件分析發(fā)光條帶灰度值，目的蛋白和內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.2.4 Western印跡法檢測高濃度藥物處理后，成熟脂肪細胞其他棕色脂肪功能性基因蛋白水平變化 同樣方法誘導(dǎo)3T3-L1脂肪前體細胞分化，在誘導(dǎo)3T3-L1細胞分化過程中的第3天予高濃度T2(100 nmol/L)處理96 h。細胞分化成熟后用Western印跡法檢測細胞其他棕色脂肪功能性基因如誘導(dǎo)細胞死亡DNA片段化因子α樣效應(yīng)因子A(CIDEA)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α(PGC-1α)蛋白水平變化，Western印跡法操作大致同上。

2 結(jié)果

2.1 光鏡結(jié)果 3T3-L1脂肪前體細胞呈成纖維細胞樣形態(tài)，細胞呈梭形，胞漿中無脂滴(圖1，封3)。應(yīng)用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+地塞米松+胰島素誘導(dǎo)分化后，細胞進入分化階段，細胞體積增大，變圓，胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)脂滴，脂滴顆粒在細胞核周圍出現(xiàn)，逐漸增多、增大，直至遍布細胞內(nèi)，細胞核可被脂滴擠到周圍。誘導(dǎo)分化后6～9 d，80%～90%的細胞已分化產(chǎn)生脂滴，脂肪細胞分化成熟后脂滴富集于核周圍，油紅O染色后成熟脂肪細胞內(nèi)出現(xiàn)紅染顆粒(圖2，封3)，證明鏡下所見細胞內(nèi)顆粒為脂滴。

2.2 實時熒光定量PCR結(jié)果 UCP-1 mRNA水平在3T3-L1脂肪前體細胞表達較低，在其分化過程中予不同濃度T2(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)干預(yù)后，分化成熟的脂肪細胞UCP-1 mRNA表達增加，在100 nmol/L濃度T2作用條件下效應(yīng)最顯著，如圖3。干預(yù)組(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)同對照組相比(0 nmol/L)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.97、11.77、17.70，P均lt;0.05)。多組之間采用單因素方差分析，因方差不齊，所以采用非參數(shù)檢驗(χ2=10.39,Plt;0.05)，表明各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

2.3 Western結(jié)果 UCP-1蛋白水平在3T3-L1脂肪前體細胞表達較低，在其分化過程中予不同濃度T2(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)干預(yù)后，分化成熟的脂肪細胞UCP-1蛋白表達水平有所改變(t=13.31、14.55、23.62，P均lt;0.05)，在1 nmol/L條件下與對照組相比略下降，在10 nmol/L、100 nmol/L條件下與對照組相比蛋白表達量升高，其中在100 nmol/L條件下蛋白表達水平增加最顯

著，由于T2用甲醇和氨水共同溶解配置，所以設(shè)置了未加藥物溶劑空白對照組，結(jié)果顯示差異不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.725,Pgt;0.05)。同時，在100 nmol/L條件下，棕色脂肪其他功能性基因如CIDEA、PGC-1α蛋白水平表達增加(t=15.92、17.36，P均lt;0.05)，見圖4，5。

3 討論

米色脂肪組織是近年發(fā)現(xiàn)的除白色脂肪組織和棕色脂肪組織外的第三類脂肪組織，它具有較低的產(chǎn)熱能力和少量的線粒體，一旦受到刺激，可以呈現(xiàn)更多的類似棕色脂肪的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)上的特征，UCP-1表達增多，產(chǎn)熱能力增強[7-8]。目前許多研究已經(jīng)證明，人類和嚙齒類動物都具有棕色和米色脂肪組織。如何促進更多白色脂肪向米色脂肪及棕色脂肪的轉(zhuǎn)化成為通過增加能量消耗而治療肥胖的一種新方法。動物和細胞研究已經(jīng)證明，一些轉(zhuǎn)錄子及其調(diào)節(jié)因子、非轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、激素均可以影響白色脂肪棕色化的過程[9]。甲狀腺激素可通過與棕色脂肪細胞上的甲狀腺激素受體(TR)α1結(jié)合而激動棕色脂肪組織產(chǎn)熱，還可以通過與棕色脂肪組織上的TRβ1結(jié)合而誘導(dǎo)UCP-1基因的表達增加。在人類脂肪源性的多能干細胞分化成成熟白色脂肪細胞的過程中，T3通過與TRβ結(jié)合，在不增加白色脂肪細胞特異分子表達的情況下可以誘導(dǎo)UCP-1、PGC-1α表達，并且這種作用呈T3劑量依賴性[10]。T2是一種T3脫碘形成的具有生物活性的天然代謝產(chǎn)物，所以推測T2亦可以誘導(dǎo)白色脂肪棕色化[3]。

注：不同濃度藥物干預(yù)組與對照組相比， aPlt;0.05；UCP-1：解耦聯(lián)蛋白-1；T2：3,5-二碘-L-甲狀腺素圖3 不同濃度T2對脂肪細胞分化成熟后UCP-1 mRNA表達的影響

注：不同濃度藥物干預(yù)組與對照組相比， aPlt;0.05；UCP-1：解耦聯(lián)蛋白-1；T2：3,5-二碘-L-甲狀腺素圖4 不同濃度T2對細胞分化成熟后UCP-1蛋白表達的影響

注：不同濃度藥物干預(yù)組與對照組相比，aPlt;0.05；T2：3，5-二碘-L-甲狀腺素；UCP-1：解耦聯(lián)蛋白-1；PGC-1α：過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α；CIDEA：誘導(dǎo)細胞死亡DNA片段化因子α樣效應(yīng)因子A圖5 100 nmol/L T2對細胞分化成熟后CIDEA、PGC-1α蛋白表達的影響

由于3T3-L1脂肪前體細胞可較好地模擬脂肪細胞分化和活體脂肪組織的功能，因此目前已成為肥胖及體外脂肪細胞分化研究的一個常用工具。本實驗結(jié)果顯示，光鏡下，3T3-L1脂肪前體細胞呈成纖維細胞樣形態(tài)，細胞呈梭形，胞漿中無脂滴；誘導(dǎo)分化后，細胞體積增大，變圓，予油紅O染色可見細胞內(nèi)有大量區(qū)域被染色，部分成環(huán)狀，這是3T3-L1脂肪前體細胞分化成熟后油紅染色的典型改變。

本研究結(jié)果顯示3T3-L1脂肪前體細胞UCP-1在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均表達較低，在其分化過程中予不同濃度T2(1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)干預(yù)后，雖然在濃度1 nmol/L條件下的蛋白水平略降低，但由于蛋白表達可以受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，也可以受翻譯水平的調(diào)控，所以在翻譯水平的調(diào)控可以導(dǎo)致蛋白表達和mRNA水平不成比例；在其他濃度條件下，分化成熟后的脂肪細胞UCP-1表達增加。相同條件下棕色脂肪其他功能基因CIDEA、PGC-1α蛋白水平在T2高濃度刺激后也表達增加。表明在細胞水平上，T2可以增強脂肪前體細胞在向白色脂肪細胞分化過程中棕色脂肪組織功能基因的表達，使分化成熟的白色脂肪細胞具有棕色脂肪特征。還有研究表明，在3T3-L1脂肪前體細胞分化成熟后給予T3處理，UCP-1表達水平在T3濃度為5 nmol/L時開始升高，50 nmol/L開始下降，在5 nmol/L達到頂峰，可以推測甲狀腺激素所起作用與劑量密切相關(guān)[11]。但是T2作用于細胞的機制到底如何并不明確。

以往研究表明AMP活化蛋白激酶(AMPK)參與UCP-1的誘導(dǎo)形成過程[12]。AMPK激動劑如二甲雙胍已經(jīng)被證明可以減輕體重和降低血糖[13]。有研究表明，T3增強脂肪細胞產(chǎn)熱的作用與TR分布有關(guān)，AMPK參與其中，其可能是T3調(diào)節(jié)能量代謝的下游信號通路，T2可能通過類似途徑起作用[11]。還有研究表明T2不通過TR起作用，但可以增強肝臟核SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)活性。離體實驗證明，T2可直接作用于SIRT1，導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c被脫去乙?；瑥亩棺厣窘M織功能基因上調(diào)[4]。

綜上所述，T2可以增強3T3-L1脂肪前體細胞向成熟白色脂肪細胞分化過程中UCP-1的表達，從而證實了T2誘導(dǎo)白色脂肪棕色化的可能性。但其相關(guān)機制尚需進一步研究。

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Effectsof3,5-diiodo-L-thyronineonbrowningofwhiteadiposetissue

KeMengting*,SunJiazhong,LiYang.

*DepartmentofEndocrinology,WuhanRedCrossHospital,Wuhan430071,China

Correspondingauthor:SunJiazhong,Email：sjz300@163.com

ObjectiveTo explore the effects of 3,5-diiodo-L-thyronine(T2) on browning of white adipose tissue.MethodsDifferentiation of 3T3-L1 adipose precursor cells were induced and identified by oil red O staining. During the differentiation process, 3T3-L1 were treated by different concentrations of T2(1 nmol/L,10 nmol/L,100 nmol/L). After the maturation of 3T3-L1, the level of uncoupling protein-1(UCP-1) mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively. Specific proteins of brown adipose tissue including cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha like effector A (CIDEA) and peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α) were detected by Western blotting only in cells treated by 100 nmol/L T2.Results3T3-L1 adipose precursor cells were fibroblast-like without liquid droplets in the cytoplasm, but after maturation, a large number of annular lipid drops were observed under light microscope by oil red O staining. The level of UCP-1 mRNA in mature fat cells were increased (t=3.97, 11.77,17.7; allPlt;0.05) and the level of protein were also changed(t=13.31, 14.55, 23.62; allPlt;0.05), especially in cells treated by 100 nmol/L T2. The brown adpose tissue specific proteins CIDEA and PGC-1α were also increased in cells treated by 100 nmol/L T2(t=15.92,17.36; allPlt;0.05).ConclusionT2induces the expression of specific genes of brown adipose tissue in mature fat cells which are differentiated from 3T3-L1 adipose precursor cells.

3T3-L1 adipose precursor cells; Browning of white adipose; 3,5-Diiodo-L-thyronine; Obesity

湖北省科技廳項目(2014CFB204)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.06.03

430000 武漢紅十字會醫(yī)院內(nèi)分泌科(柯孟婷);430071 武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科(孫家忠,李揚)

孫家忠，Email： sjz300@163.com

FundprogramThe Project of Science Department of Hubei Province(2014CFB204)

2015-10-12)