薛 韜 仝秀清

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010059)

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寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的影響

薛 韜 仝秀清

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010059)

目的 探討寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的抑制作用。方法 SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、寧癇顆粒組、卡馬西平組以及聯(lián)合組，采用海馬CA3局部注射海人酸方法制作大鼠癲癇模型，造模后用苯妥英鈉灌胃14 d對模型進行篩選。繼續(xù)飼養(yǎng)2 w后股動脈取血并分離血清，檢測各組大鼠血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量變化。結果 模型組中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均明顯高于正常對照組(P<0.05)；寧癇顆粒組和卡馬西平組中三種因子表達顯著下降(P<0.05)，且聯(lián)合組中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達下降最顯著(P<0.05)。結論 寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平具有明顯的免疫抑制作用，比兩藥單用效果突出。推測兩藥可能通過協(xié)同作用抑制炎癥反應進而阻斷癲癇發(fā)作，達到治療癲癇的目的。

難治性癲癇；寧癇顆粒；卡馬西平

癲癇(epilepsy)是大腦神經元突發(fā)性異常持續(xù)放電，導致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病〔1〕。盡管目前多數(shù)癲癇發(fā)作經藥物治療可得到控制，但有部分患者對抗癲癇藥物治療反應差，癲癇發(fā)作難以控制，稱為難治性癲癇(IE)。雖然通過外科手術可以控制癲癇發(fā)作，但仍然有大約半數(shù)的IE患者外科治療無效或無手術適應證。最新研究發(fā)現(xiàn)癲癇病理機制與炎癥反應息息相關，而臨床上，激素和免疫球蛋白也已經用于IE的治療〔2〕。但迄今為止，對IE患者血清非特異性炎癥指標的研究極為有限。本實驗通過檢測IE模型大鼠血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量間接反映IE大鼠炎癥反應發(fā)展程度，探究寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平對IE大鼠免疫機制方面的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康清潔級雄性SD大鼠100只。動物生產許可證號：SCXK(豫)2015-18。造模前每組均以大鼠標準飼料(鄭州大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供)喂養(yǎng)，自由飲水，適應性喂養(yǎng)至體重(250±20)g后進行造模及后續(xù)實驗。

寧癇顆粒藥物組成：青黛、石菖蒲、全蝎，均購于鄭州大學第一附屬醫(yī)院中藥房。卡馬西平片(江蘇恩華藥業(yè)，生產批號：H321502);苯妥英鈉片(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，生產批號：H19621702)；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，生產批號：S10J0351。

1.2 方法

1.2.1 IE模型大鼠制備 10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將頭部固定于腦立體定位儀上，剪毛、酒精消毒，沿大鼠頭部正中線作1 cm的縱向切口，3%雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前囟和冠狀縫。選擇右側海馬CA3中心區(qū)(AP:-4.00 mm,ML:4.40 mm,DV:3.8 mm)作為藥物注射靶點。用顱骨鉆小心鉆透顱骨至硬腦膜，不要傷及皮層，在鉆孔處用微量注射器注入2 μl海人酸(0.5 μg/μl)，微量注射器下針至硬腦膜下3.8 mm，在10 min內緩慢將海人酸注入右側海馬CA3中心區(qū)，留針5 min，鐘表螺絲封口，在對應的左側區(qū)域鉆孔上鐘表螺絲，并用牙科水泥封口，將電極接在鐘表螺絲上面，術后縫合頭皮。正常對照組除用生理鹽水代替海人酸外，其他操作相同。待癲癇模型制作完成后，以苯妥英鈉(0.03 g/kg,1.2 mg/ml)口服給藥14 d，行為學觀察大鼠仍有部分復雜性發(fā)作，腦電圖記錄有癲癇波者，證實IE大鼠造模成功。

1.2.2 分組及給藥 IE大鼠模型制備過程中死亡7只，24只因癲癇發(fā)作情況不符合要求而棄用。剩余符合條件的大鼠隨機分為模型組、寧癇顆粒組、卡馬西平組以及聯(lián)合組各9只，且每組給予相對應的藥物(按照臨床常用飲片劑量折算)灌胃14 d進行干預，正常對照組和模型組給予等量的生理鹽水作為對照。

1.2.3 檢測指標 采用股動脈取血法收集各組大鼠動脈血5 ml于真空抗凝采血管，4℃，4 000 r/min低溫離心15 min，分離取上清液，采用ELISA方法，嚴格按照相應ELISA試劑盒操作說明，檢測各組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的含量變化。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行t檢驗。

2 結 果

與正常對照組相比，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的表達顯著升高。單用寧癇顆?；蚩R西平進行藥物干預后，三種因子的表達較模型組均有所下降，但聯(lián)合組干預后對三種因子的抑制最明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

1)與正常對照組比較，2)與模型組比較，3)與寧癇顆粒組比較，4)與卡馬西平組比較：均P<0.05

3 討 論

癲癇的發(fā)病機制至今尚未闡明，越來越多的研究表明，炎癥過程與癲癇的發(fā)作密切相關〔3，4〕。對IE患者術后腦組織神經病理切片檢測發(fā)現(xiàn)，腦內存在一種持續(xù)且復雜的炎癥反應〔5〕。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，腦部炎癥反應和癲癇進程之間互為因果〔6〕。現(xiàn)已證實高遷移率族蛋白1/Toll樣受體4(HMGB1/TLR4)信號通路與IE密切相關，激活HMGB1/TLR4 通路主要生成與釋放炎癥因子IL-6、IL-1β以及促炎因子TNF-α 等細胞因子〔7〕。TLR4可與巨噬細胞、中性粒細胞分泌的HMGB1結合，促使核因子(NF)-κB活化誘導炎癥發(fā)生，激活后可通過NF-κB信號途徑生成并釋放大量的促炎細胞因子，促炎因子又可以反過來促進HMGB1 的分泌，造成癲癇反復發(fā)作，預后不良〔8〕。故IL-6,IL-1β和TNF-α逐漸被采用作為判斷癲癇發(fā)作的血清標志物。

IL-1β、IL-6以及TNF-α表達于激活的星形膠質細胞以及小膠質細胞上，在癲癇發(fā)作的腦內可檢測到上述炎性因子的受體表達明顯上調〔9〕。IL-1β在腦內的含量增高可加重炎癥反應，引起驚厥。IL-6的過量表達可以促進小鼠海馬的星形膠質細胞增生，引起海馬區(qū)腦電圖呈癲癇樣改變〔10〕。TNF-α可以誘導T、B淋巴細胞的活化，介導腦局部組織的炎癥反應，加劇IL-1β、IL-6對內皮細胞的損傷及血腦屏障的損害程度，誘導癲癇的發(fā)生〔11〕。有研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α對癲癇的反復發(fā)作和加劇起促進作用；同時，癲癇引起的炎癥因子也會加重IE的發(fā)作與反復〔12〕。本文采用海人酸誘導大鼠IE后，檢測發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯升高，表明免疫細胞處于活化狀態(tài)，以上三種細胞因子參與了IE大鼠的異常免疫應答，從而導致細胞因子網絡失衡，進而引起細胞免疫功能紊亂?？R西平和寧癇顆?？赡苁峭ㄟ^直接或間接作用于HMGB1/TLR4 信號通路，抑制TLR4的活性，進而減弱其與巨噬細胞和中性粒細胞分泌的HMGB1結合，導致HMGB1/TLR4 信號途徑生成與釋放的IL-1β、IL-6以及TNF-α含量下降，從而抑制炎癥反應，阻止腦損傷，起到保護腦細胞的作用。本研究中卡馬西平和寧癇顆粒單獨應用的療效弱于聯(lián)合應用組，推測卡馬西平和寧癇顆粒都只是干預HMGB1/TLR4 信號途徑的某一局部反應，而兩藥聯(lián)合應用后全面抑制整條通路，促使炎癥因子的表達下降更為明顯。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

仝秀清(1971-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事神經電生理方面的研究。

薛 韜(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事癲癇方面的研究。

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A

1005-9202(2016)20-4985-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.019