趙辛元,李 丹,柯志強(qiáng)

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.咸寧市中心醫(yī)院；3.湖北科技學(xué)院糖尿病與心腦血管湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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姜黃素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用研究*

趙辛元1,李 丹2,柯志強(qiáng)3**

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.咸寧市中心醫(yī)院；3.湖北科技學(xué)院糖尿病與心腦血管湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 探討姜黃素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 雄性SD大鼠110只,隨機(jī)抽取10只大鼠作為正常對(duì)照組(Con組)，其余100只大鼠給予高糖高脂飲食喂養(yǎng)8周后,腹腔注射鏈脲佐菌素STZ 35 mg/kg，給藥72h隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為造模成功。糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病腎病組(DN組)、姜黃素治療組(DN+Cur組)。測(cè)定血清肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)水平,測(cè)定腎臟組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)含量，測(cè)定24h尿蛋白含量,Western blotting方法檢測(cè)腎臟組織中TGF-β1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)。結(jié)果 姜黃素治療后可明顯改善糖尿病所致的大鼠血清中Crea、BUN升高變化，抑制腎臟中MDA的產(chǎn)生，并升高SOD、GSH-Px、CAT活性，減少24h尿蛋白含量，下調(diào)糖尿病大鼠腎臟組織TGF-β1、P62的蛋白表達(dá)，上調(diào)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)。結(jié)論 姜黃素對(duì)大鼠糖尿病腎病具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，可能與TGF-β1調(diào)控自噬有關(guān)。

糖尿病腎??；姜黃素；氧化應(yīng)激；TGF-β1；自噬

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病并發(fā)癥之一，使糖尿病的死亡率呈上升趨勢(shì)。DN最經(jīng)典定義是尿白蛋白進(jìn)行性增加,與之相伴的是血壓升高,腎小球?yàn)V過作用下降,最終導(dǎo)致腎衰[1]，與之伴隨的復(fù)雜代謝紊亂，其發(fā)病機(jī)理目前尚不完全清楚。姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物中提取的一種黃色酚類化合物，研究表明[1-3]Cur具有抗氧化、抗腫瘤、降糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究通過復(fù)制DN模型，探討Cur對(duì)DN的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 pH計(jì)(Mettler Toledo公司)；Scanspeed1730R高速冷凍離心機(jī)(丹麥Labgene公司)；自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE公司)；STZ(Sigma公司，貨號(hào)S0130)；生化試劑盒均購(gòu)于南京建成研究所；β-actin(谷歌生物)、TGF-β1、P62、LC3-Ⅱ(Sigma公司)；其余均為進(jìn)口或者國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.2 分組情況 SPF級(jí)SD大鼠，健康雄性110只，體重100～160g，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con組，n=10)和糖尿病模型制備組(n=100)。Con組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組大鼠以高糖高脂飼料(在普通飼料的基礎(chǔ)上加入10%的白砂糖和20%的豬油)喂養(yǎng)。飼養(yǎng)4周后，禁食12h，糖尿病模型制備組大鼠一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozoticin，STZ)35mg/kg(用pH=4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。STZ腹腔注射72h，鼠尾取血測(cè)定隨機(jī)血糖。糖尿病模型成功大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L，未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)者再次注射STZ，剔除仍未成功者。糖尿病模型成功大鼠51只，隨機(jī)分為糖尿病腎病組(DN組，n=25)、姜黃素治療組(DN+Cur組，n=26)。造模成功后，DN組大鼠繼續(xù)喂以高糖高脂飲食，DN+Cur組大鼠則每天給予高糖高脂飼料和Cur300mg/kg(Cur由1%的羧甲基纖維素鈉配制)處理。實(shí)驗(yàn)過程中，監(jiān)測(cè)大鼠體重及攝食量。每2周禁食12h，鼠尾取血檢測(cè)空腹血糖1次。Cur處理16周后，處死大鼠，檢測(cè)后續(xù)相關(guān)指標(biāo)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中仍有模型組死亡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清中生化指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)怪鲃?dòng)脈取血，3000r/min離心10min，取上清，按照試劑盒說明書測(cè)定Crea、BUN含量。

1.3.2 腎臟組織中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活力測(cè)定 藥物治療16周后取出腎臟，制備成腎臟勻漿，離心提取上清，按照試劑盒相關(guān)程序操作。

1.3.3 24h尿蛋白測(cè)定 處死大鼠前一天收集24h尿量，參照試劑盒說明書測(cè)定24h尿蛋白含量。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)腎臟組織中TGF-β1、P62和LC3-Ⅱ表達(dá) 取50mg腎臟組織置于EP管中，按照體重∶體積=1∶15的比例加入750μL組織裂解液，冰上勻漿后，15000r/min、4℃離心15min后，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)為一致。上樣后，80V電泳30min左右，將電壓調(diào)為100～120V，溴酚藍(lán)到凝膠底部4/5左右時(shí)停止電泳。300mA將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，TBST洗滌4次，5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加入用3%BSA參照抗體說明書稀釋的一抗TGF-β1、P62、LC3-Ⅱ和β-actin(1∶1000)，置于4℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌4次后，加入二抗(1∶5000)室溫孵育1h。TBST漂洗后，化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影成像，SYNGENE自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況，條帶用Quatity One軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，行One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 Cur對(duì)STZ所誘導(dǎo)的糖尿病大鼠終體重、腎體質(zhì)比、生化指標(biāo)的影響 注射STZ之前，各組之間比較體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。注射STZ造模成功后，DN組大鼠毛色黯淡無光澤，出現(xiàn)多食多尿，尿液渾濁，體重逐漸下降。實(shí)驗(yàn)?zāi)cCon組相比，DN組大鼠體重均下降明顯(P<0.05)；但與DN組比較，DN+Cur組大鼠體重顯著升高(P<0.05)。

表1 姜黃素對(duì)STZ所誘導(dǎo)的糖尿病大鼠終體重、腎體質(zhì)比、生化指標(biāo)的影響±s)

與Con組比較，*P<0.05;與DN組比較，#P<0.05

2.2 腎臟組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 與Con組比較，DN組SOD、GSH-Px和CAT活性顯著下降而MDA含量顯著升高(P<0.05)。Cur治療后可升高腎臟SOD、GSH-Px和CAT活性同時(shí)降低MDA含量(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 姜黃素對(duì)STZ所誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響±s)

與Con組比較，*P<0.05;與DN組比較，#P<0.05

2.3 腎臟組織中TGF-β1、P62和LC3-Ⅱ的變化 如圖1(封二)所示，與Con組比較，DN組大鼠腎臟組織中TGF-β1、P62表達(dá)顯著增加，LC3-Ⅱ表達(dá)顯著減少，而DN+Cur組與DN組比較TGF-β1、P62表達(dá)減少和LC3-Ⅱ表達(dá)增加(P<0.05)。

3 討 論

Cur是天然藥物中的一種，對(duì)多種慢性疾病具有有益的影響而沒有明顯的不良反應(yīng)。多種機(jī)制在DN的發(fā)生和發(fā)展中起作用，例如：氧化應(yīng)激、血脂異常、腎血液動(dòng)力學(xué)改變、非酶糖基化蛋白增加、多元醇途徑和MAPK信號(hào)通路激活。本研究中，DN大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px和CAT活性活力顯著降低，而MDA含量顯著增高，給予Cur治療后腎臟組織中SOD、GSH-Px和CAT活性活力顯著升高，而脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA顯著下降，顯示Cur具有較強(qiáng)的抗氧化能力。DN大鼠血清中BUN、Crea含量顯著增多，給予Cur治療后血清中BUN、Crea含量顯著減少，而24h尿蛋白含量與此一致，這表明Cur可能通過抗氧化而產(chǎn)生腎臟保護(hù)作用。

在DN的眾多發(fā)病機(jī)制中，自噬引起研究人員的特別關(guān)注[4-5]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,自噬是受損或額外蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的分解代謝過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和完整性中起重要作用。自噬失調(diào)與癌癥、神經(jīng)退行性病變、DN和感染性疾病等相關(guān)。研究顯示在DN的發(fā)病過程中自噬受損，在人類疾病中，大量證據(jù)顯示找到激活和維持自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有腎臟保護(hù)作用，自噬有望成為阻止或緩和DN的一個(gè)潛在靶標(biāo)[6]。本研究中觀察到DN大鼠腎臟組織中P62的表達(dá)明顯增多,而LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯減少，而Cur治療后可顯著降低P62的表達(dá),而顯著升高腎臟LC3-Ⅱ的表達(dá)。

DN的特征是細(xì)胞肥大、腎臟纖維化過度和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)沉積，隨后，TGF-β1刺激DN，觸發(fā)腎小球和管狀基膜增厚，最后導(dǎo)致腎小球硬化和腎纖維化，導(dǎo)致腎功能下降。研究顯示Cur使TGF-β1的表達(dá)下調(diào)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積而具有腎臟保護(hù)作用[1]。大量研究顯示TGF-β1調(diào)控自噬,自噬在正常和疾病狀態(tài)下調(diào)控許多與腎臟纖維化相關(guān)的重要環(huán)節(jié),例如腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和DN[7]。本研究中，觀察到DN大鼠腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)明顯增加，而Cur治療后可顯著減少腎臟TGF-β1的表達(dá)。

與許多天然藥物一樣，Cur可能具有多作用靶點(diǎn)，從而具有治療許多疾病的作用。本研究顯示，Cur對(duì)DN大鼠腎臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，也可能與TGF-β1調(diào)控自噬有關(guān)。本研究為尋求開發(fā)新的抗糖尿病腎病的藥物提供了新的思路。

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Protective Effects of Curcumin on Renal Tissue in Diabetic Nephropathy Rats and its Mechanisms

ZHAO Xin-yuan,LI Dan,KE Zhi-qiang

(DepartmentofMedicine,ClinicMedicalCollegeofHubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To study the protective effects of curcumin (Cur) on renal tissue in diabetic nephropathy rats and its possible mechanisms.Methods SD rats were divided into control group, diabetic model group and DN+Cur 300 mg/(kg·d) group. The model of diabetes was induced with high fat diet and intraperitoneal injection of 35 mg/kg streptozotocin (STZ). Blood glucose level was measured 72 h after STZ injection. After treatment for 16 weeks, the levels of creatinine (Crea) and blood urea nitrogen (BUN) in serum,the contents of malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px) and hydrogen peroxidase(CAT) and 24 h urine protein were measured. The protein expression of TGF-β1，p62 and LC3-Ⅱ were detected by Western blotting.Results Curcumin significantly decreased the blood Crea，BUN and 24 h urine protein levels，increased the body weight，inhibited MDA content and elevated GSH-Px，SOD and CAT activities in diabetic rat renal tissue. In addition，curcumin treatment also markedly inhibited the diabetes-induced protein expression of TGF-β1，p62，increased the expression of LC3-Ⅱ.Conclusion Curcumin has protective effect on diabetic nephropathy and the mechanisms may be involved in the regulation of oxidative stress and autophagy.

Diabetic nephropathy;Curcumin;Oxidative stress;TGF-β1；Autophagy

湖北科技學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(ky14068)

R285.5

A

2095-4646(2016)05-0369-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0369

2016-05-31)

**通訊作者，E-mail：kezhiqiang86@163.com