趙 苗，柯婷梅，歐陽(yáng)昌漢

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

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姜黃素對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠記憶獲得和鞏固障礙的影響

趙 苗，柯婷梅，歐陽(yáng)昌漢*

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

目的 研究姜黃素對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠記憶獲得和鞏固障礙的保護(hù)作用。方法 昆明種小鼠隨機(jī)分成5組：正常組、模型組和姜黃素低、中、高劑量組(100、200、400mg/kg)。分別用東莨菪堿和亞硝酸鈉建立學(xué)習(xí)記憶獲得和鞏固障礙模型，避暗法和Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果 姜黃素可顯著縮短用東莨菪堿建造的記憶獲得障礙模型小鼠在水迷宮中尋找平臺(tái)的潛伏期以及撤去平臺(tái)后小鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間(P<0.05)；明顯減少用亞硝酸鈉建造的記憶鞏固障礙模型小鼠避暗反應(yīng)的錯(cuò)誤次數(shù)，增長(zhǎng)小鼠的潛伏期(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素能改善東莨菪堿和亞硝酸鈉所致小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固障礙。

姜黃素；東莨菪堿；亞硝酸鈉；記憶障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年期癡呆的最普通類型，它是一種早期為記憶障礙，然后認(rèn)知功能不斷退化，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)精神癥狀和不同程度的行為能力障礙為特征的中樞神經(jīng)退行性疾病[1]，盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AD的病因及發(fā)病機(jī)理的研究已達(dá)到分子水平，但在一直沒有尋找到一些有效的藥物治療，近年來有許多學(xué)者將尋找治療AD的藥物轉(zhuǎn)向了中國(guó)傳統(tǒng)藥物。

姜黃素(Curcumin)是姜科植物中提取得到的黃色色素，為酸性酚類抗氧化物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-3]表明，姜黃素抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改善缺血再灌注損傷等多種生物學(xué)功效，但其是否對(duì)神經(jīng)退行性病變及學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本課題旨在通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察姜黃素對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得和鞏固障礙的影響，進(jìn)而為AD記憶損害的研究，中藥開發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康昆明種小白鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(24±2)g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2008-0004。

1.2 藥品及試劑 姜黃素:西安華萃生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，純度>95%；氫溴酸東莨菪堿注射液:上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為H31021519；亞硝酸鈉：重慶藥友制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為H50020585；羧甲基纖維素鈉:天津市恒興化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 Morris水迷宮設(shè)備(直徑100cm×高50cm)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品；ZH-500型小鼠避暗儀(40cm×12cm)，安徽淮北正華生物儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙模型的建立[4]昆明種小鼠50只隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、姜黃素低、中、高劑量組(100、200、400mg/kg)。將姜黃素溶入1%羧甲基纖維素鈉溶液中，灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)14d。于灌胃給藥第9d開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。除對(duì)照組外，各小鼠于訓(xùn)練前15min腹腔注射東莨菪堿2mg/kg。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備由圓形水池和水池上空攝像機(jī)以及帶Morris數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)組成。實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分，訓(xùn)練前24h將小鼠放在水池里自由游泳2min，以適應(yīng)游泳并篩去不會(huì)游泳小鼠。第一部分定位航行實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練開始前先讓小鼠在平臺(tái)上適應(yīng)10s，后隨機(jī)從1個(gè)象限的入水點(diǎn)把小鼠面向池壁放人水池中，時(shí)限為120s，記錄小鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間(即為逃避潛伏期)，再由下一象限入水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)象限之間的訓(xùn)練時(shí)間相隔1h，若小鼠在120s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)停留10s，這時(shí)逃避潛伏期記為120s。小鼠訓(xùn)練完后擦干放入鼠籠，以免小鼠感冒，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d。第二部分空間探索實(shí)驗(yàn)：在訓(xùn)練第6d拿掉水下平臺(tái)，從原平臺(tái)所在象限的對(duì)面象限的入水點(diǎn)將小鼠放入水池，記錄在120s內(nèi)小鼠穿過平臺(tái)所在象限的時(shí)間。

1.4.2 亞硝酸鈉致小鼠記憶鞏固障礙模型的建立[5]另取昆明種小鼠50只，實(shí)驗(yàn)分組與給藥同上。于灌胃給藥的第13d開始進(jìn)行被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。除對(duì)照組外，各組小鼠于訓(xùn)練結(jié)束后立即皮下注射亞硝酸鈉溶液120mg/kg。

被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)設(shè)備由穿梭箱、刺激控制器和計(jì)算機(jī)組成。穿梭箱包括左右兩個(gè)同等大小的隔室(compartment)，其中一個(gè)隔室用黑色布包裹，形成暗箱，另外一個(gè)為明室，兩個(gè)隔室之間有一直徑為3.0cm的洞口。隔室地板為銅欄，只有暗箱的銅柵地板與刺激器相聯(lián)，刺激器可通36v的電流。訓(xùn)練之前先將小鼠頭背對(duì)著洞口放入明室，適應(yīng)環(huán)境3min，然后通電流，小鼠因喜暗惡光習(xí)性進(jìn)入暗室則遭受電擊，此時(shí)小鼠可自行返回明室，獲得記憶，按此方式訓(xùn)練5min。電刺激24h后對(duì)小鼠進(jìn)行記憶保持試驗(yàn)，需要記錄小鼠首次進(jìn)入暗室的時(shí)間(即為避暗潛伏期)，還需記錄5min之內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(即為錯(cuò)誤次數(shù))，小鼠5min之內(nèi)未進(jìn)入暗室的按潛伏期為300s計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙的影響 定向航行實(shí)驗(yàn)顯示：各組小鼠的游泳速度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組小鼠的平均逃避潛伏期越來越短。訓(xùn)練的第1、2d，各組小鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；從第3d起，與正常組相比，模型組小鼠的平均潛伏期明顯增長(zhǎng)(P<0.01)，提示東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)獲得性學(xué)習(xí)記憶功能障礙。從第3d起，與模型組比較，中、高劑量姜黃素組小鼠平均潛伏期明顯縮短(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 姜黃素對(duì)東莨菪堿致記憶獲得障礙小鼠逃避潛伏期的影響±s，n=10)

與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

空間探索實(shí)驗(yàn)顯示：平臺(tái)撤銷后，正常組和姜黃素中劑量組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡大部分在原平臺(tái)象限，其次小鼠活動(dòng)比較多的象限是在原平臺(tái)象限相鄰的左右兩個(gè)象限，最少活動(dòng)軌跡的是原平臺(tái)象限對(duì)面的那個(gè)象限；模型組小鼠基本上是圍繞著池壁游泳，運(yùn)動(dòng)軌跡隨機(jī)分布于各象限之中，沒有什么規(guī)律，而且穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)較少。結(jié)果見圖1(封二)，與正常組比較，模型組小鼠在原平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間明顯縮短(P<0.01)。而低、高劑量姜黃素組與模型組比較停留時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中劑量姜黃素組比模型組小鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 姜黃素對(duì)東莨菪堿致記憶獲得障礙小鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間的影響±s，n=10)

與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

2.2 姜黃素對(duì)亞硝酸鈉所致小鼠記憶鞏固障礙的影響 在24h后記憶保持測(cè)試中，與正常組小鼠相比，模型組小鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)明顯變多，且逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，說明亞硝酸鈉誘導(dǎo)的模型小鼠的記憶鞏固出現(xiàn)障礙。與模型組相比，中劑量姜黃素顯著減少了小鼠5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)，低、高劑量姜黃素組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)也有一定的減少，但與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，中、高劑量姜黃素與模型組相比尚可明顯延長(zhǎng)小鼠避暗潛伏期(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 姜黃素對(duì)亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙小鼠的影響±s，n=10)

與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)作為是一種在病理學(xué)上主要以神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失、皮膚出現(xiàn)老年斑等為顯著特征，臨床表現(xiàn)為記憶力逐漸衰退、認(rèn)知、精神、行為出現(xiàn)異常情況，病因極其復(fù)雜的一種慢性神經(jīng)退行性疾病[6]。到目前為止，雖然還沒有任何一個(gè)動(dòng)物模型可完全模擬，但制備動(dòng)物模型可以從整體行為水平研究學(xué)習(xí)記憶。學(xué)習(xí)是人和動(dòng)物為了適應(yīng)環(huán)境反復(fù)練習(xí)、經(jīng)驗(yàn)的過程，記憶是學(xué)習(xí)后經(jīng)驗(yàn)的保持和再現(xiàn)，所以學(xué)習(xí)和記憶是兩個(gè)相互聯(lián)系的復(fù)雜過程，包含記憶的獲取、鞏固以及再現(xiàn)等多個(gè)環(huán)節(jié)[4]。

抗膽堿藥東莨菪堿通過阻斷M受體，可阻斷大腦皮層和海馬等處的膽堿能神經(jīng)傳遞，抑制條件反射的形成，能明顯干擾動(dòng)物學(xué)習(xí)以及學(xué)習(xí)后的短時(shí)記憶，影響記憶的獲得環(huán)節(jié)，引起記憶獲得性障礙[7]。腦血流量約占全身總血流量的17%左右，血液循環(huán)障礙可直接導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，此時(shí)腦的正常生理功能就會(huì)遭到破壞，從而損害記憶功能。亞硝酸鈉為致腦缺氧劑，通過誘導(dǎo)機(jī)體血紅蛋白變性，進(jìn)而引起腦組織缺血缺氧，造成腦缺血性記憶鞏固障礙。因此，降低中樞乙酰膽堿酯酶活性、改善膽堿能神經(jīng)傳遞以及改善神經(jīng)細(xì)胞血流供應(yīng)與能量代謝的藥物在阿爾茨海默病的防治中具有重要作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，姜黃素可降低衰老大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶活性，改善中樞膽堿能代謝；可通過抗炎、抗氧化、改善腦組織血流供應(yīng)等多種途徑保護(hù)缺血神經(jīng)細(xì)胞，這些效應(yīng)均為姜黃素在阿爾茨海默病的防治中提供可能。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能縮短?hào)|莨菪堿小鼠記憶獲得障礙模型在水迷宮中尋找平臺(tái)的潛伏期，以及延長(zhǎng)撤去平臺(tái)后小鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間；姜黃素能夠減少亞硝酸鈉小鼠記憶鞏固障礙模型避暗反應(yīng)的錯(cuò)誤次數(shù)，延長(zhǎng)其潛伏期，說明姜黃素對(duì)阿爾茨海默病模型記憶獲取和鞏固障礙具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可能與恢復(fù)腦內(nèi)膽堿能代謝及改善細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

[1]李斌,謝淑玲,彭麗燕,等.3種擬癡呆動(dòng)物模型在Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試中學(xué)習(xí)記憶行為的差異[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014,7(27):683

[2]葛躍偉,高慧敏,王智民.姜黃屬藥用植物研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2007,32(23):2461

[3]羅廷順,李洪文,劉正文,等.姜黃素的提取分離與藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011,26(2):102

[4]李長(zhǎng)祿，王紅梅，王立為.腎虛型老年癡呆大鼠模型的復(fù)制[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,32(3):62

[5]皋聰,王傳社,巫冠中,等.蓯蓉總苷對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2005,16(3):162

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[7]鄧?yán)?王今朝,楊莉,等.膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體與阿爾茨海默病[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2014,41(12):1207

[8]SHUKLA P K,KHANNA V K,ALI M M,et al.Anti-ischemic effect of curcumin in rat brain[J].Neurochem Res,2008,33(6):1036

Effect of Curcumin on Memory Acquisitionand Consolidation in Alzheimer's Disease Model Mice

ZHAO Miao，KE Ting-mei，OUYANG Chang-han

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To study the effect of curcumin on memory acquisition and consolidation in Alzheimer's disease model mice.Methods Kunming mice were divided randomly into 5 groups: nomal control group，model group and low，middle，high doses of curcumin groups (100，200，400 mg/kg).The models of scopolamine-induced impairment of learning and sodium nitrite-induced impairment of memory consolidation were established in mice.Step-through test and Morris water maze test were used to observe the memory acquisition and consolidation ability.Results Oral administration of curcumin significantly reduced the numbers of errors，prolonged the latency induced by sodium nitrite in step-through test(P<0.05)，shortened escape latency in scopolamine-induced memory impairment mice in Morris water maze，and prolongedthe total time that the mice swam in the targetquadrantafter the platform was removed(P<0.05).Conclusion Curcumin can improvescopolamine andsodium nitrite-induced impairment of memory acquisition and consolidation in mice.

Curcumin; Scopolamine;Sodium nitrite;Memoryimpairment

，E-mail:176788542@qq.com

R285.5

A

2095-4646(2016)05-0372-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0372

2016-04-15)