曾甜,陳錢(qián),江茜,周吉,葉勇

(有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北大學(xué)有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430062)

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PVDF微孔濾膜負(fù)載金納米粒子用于牛奶中三聚氰胺的SERS快速檢測(cè)

曾甜,陳錢(qián),江茜,周吉*,葉勇

(有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北大學(xué)有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430062)

本文報(bào)道了一種利用聚偏二氟乙烯(Polyviny Lidene Fluoride,PVDF)微孔濾膜為載體的三聚氰胺(Melamine,MAM)的簡(jiǎn)便快速痕量分析技術(shù)。通過(guò)檸檬酸鈉還原法制得平均粒徑為30 nm的納米金溶膠,加入不同濃度的三聚氰胺后金納米粒子快速聚集,這種納米金聚集體可以通過(guò)簡(jiǎn)便快捷的過(guò)濾技術(shù)截留在PVDF微孔濾膜表面,進(jìn)而用于SERS檢測(cè),在水溶液中最低檢測(cè)濃度為0.05 mg/L。我們進(jìn)一步在牛奶樣品中進(jìn)行檢測(cè),在牛奶中檢測(cè)限可以達(dá)到1 mg/L,滿足大部分國(guó)家規(guī)定的嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg的參考標(biāo)準(zhǔn)。該分析方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、總分析時(shí)間短,易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速靈敏檢測(cè),應(yīng)用前景廣闊。

表面增強(qiáng)拉曼散射；PVDF微孔濾膜；金納米粒子；三聚氰胺

1 引言

三鹿奶粉摻加三聚氰胺事件,引起了整個(gè)社會(huì)的關(guān)注。三聚氰胺分子中含有大量的氮,用普通凱氏定氮法測(cè)定奶制品中蛋白質(zhì)含量時(shí),無(wú)法區(qū)分氮元素是來(lái)源于蛋白質(zhì)分子還是三聚氰胺。目前,已經(jīng)有許多方法可以用于準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中三聚氰胺的含量,例如酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[1]、質(zhì)譜法[2]、液相色譜法[3]、表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)[4-8]、比色法[9]等等。然而,這些方法或多或少都存在著一些不完美之處,比如需要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的樣品前處理、復(fù)雜的目標(biāo)分子分離步驟、檢測(cè)限不夠低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等等。所以,仍然有必要建立起一種快速、簡(jiǎn)單、高效的痕量分析方法,用于監(jiān)控牛奶的質(zhì)量安全。

SERS技術(shù)作為一種高效的分析檢測(cè)手段,具有靈敏度高、選擇性好、檢測(cè)范圍廣、快速、原位分析等優(yōu)點(diǎn),已成功應(yīng)用在分析化學(xué)、環(huán)境化學(xué)、食品化學(xué)和生物檢測(cè)等眾多領(lǐng)域[10]?，F(xiàn)場(chǎng)快速痕量分析應(yīng)用是SERS技術(shù)近年來(lái)最重要的發(fā)展方向之一。而要實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),必須有與之相匹配的SERS 基底。這樣的SERS 基底必須滿足以下條件：一是簡(jiǎn)單、易操作；二是重現(xiàn)性與穩(wěn)定性好；三是檢測(cè)靈敏度高；四是性價(jià)比高,經(jīng)受住市場(chǎng)的考驗(yàn)。紙質(zhì)SERS 基底[11-13]具備薄、輕、儲(chǔ)存能力大、制作工藝簡(jiǎn)單、樣品采集容易、便于攜帶、低成本、可批量生產(chǎn)、容易吸附與富集待測(cè)分子等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),有望成為最佳選擇。

本文報(bào)道了一種利用PVDF微孔濾膜為載體的三聚氰胺的簡(jiǎn)便快速痕量分析技術(shù)。向納米金溶膠中加入不同濃度三聚氰胺后金納米粒子快速聚集,這種納米金聚集體可以通過(guò)簡(jiǎn)便快捷的過(guò)濾技術(shù)截留在PVDF微孔濾膜表面,進(jìn)而構(gòu)建了SERS分析檢測(cè)平臺(tái),在水溶液中最低檢測(cè)濃度為0.05 mg/L。我們還進(jìn)一步考察了該方法在實(shí)際牛奶樣品檢測(cè)中的應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法對(duì)實(shí)際牛奶樣品中三聚氰胺含量的檢測(cè)限為1 mg/L,符合大部分國(guó)家對(duì)嬰幼兒奶粉中三聚氰胺含量要求的最低標(biāo)準(zhǔn),是一種檢測(cè)實(shí)際樣品中三聚氰胺含量的快速痕量分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)、檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺(melamine,MAM)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；新鮮的牛奶購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；?shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)產(chǎn)自美國(guó)Millipore公司的Milli-Q凈水系統(tǒng)處理后得到的去離子水；聚四氟乙烯微孔濾膜(PVDF durapore membrane,孔徑為0.45m)購(gòu)自Millipore公司；聚碳酸酯支架購(gòu)自Cole Parmer公司。

2.2 儀器與參數(shù)設(shè)置

金納米粒子溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)由美國(guó)必達(dá)泰克公司的BRC642E CCD 陣列光譜儀獲得；修飾納米粒子前后PVDF膜表面形貌由日本電子JSM6510LV掃描電子顯微鏡(SEM)表征；膜過(guò)濾過(guò)程采用保定蘭格恒流泵有限公司的多通道注射泵完成；拉曼光譜使用英國(guó)Renishaw公司Invia型共聚焦顯微拉曼光譜儀測(cè)量(儀器分辨率為1 cm-1,激發(fā)光源為He-Ne激光器,激光波長(zhǎng)為633 nm,激光器最大輸出功率為17 mW,共聚焦顯微系統(tǒng)為德國(guó)Leica公司DMLM 型顯微鏡,配備50、25、5 倍三個(gè)物鏡,激光經(jīng)過(guò)50 倍物鏡聚焦后,光斑直徑大小為1m,所有拉曼數(shù)據(jù)均為10 s 累積1次的結(jié)果。

2.3 PVDF微孔濾膜用于SERS分析載體

將PVDF圓片膜封閉于聚碳酸酯濾膜支架中,用一個(gè)1 mL的注射器吸入一定量的三聚氰胺與金溶膠的混合溶液,設(shè)定一定的流速勻速推動(dòng)注射器使混合溶液緩慢通過(guò)PVDF圓片膜,由于納米金聚集體尺寸大于微孔濾膜的孔徑,吸附有三聚氰胺的金納米聚集體停留在PVDF膜表面,另一端流出無(wú)色透明溶液,小心取出圓片膜在40℃下烘干,然后直接進(jìn)行SERS檢測(cè)。膜的修飾過(guò)程如圖1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 三聚氰胺誘導(dǎo)金納米粒子聚集的紫外表征

在金納米粒子的合成過(guò)程中,檸檬酸鈉既是還原劑又是阻礙金納米粒子聚集的穩(wěn)定劑,當(dāng)加入三聚氰胺后,氨基會(huì)與檸檬酸根結(jié)合,降低了金納米粒子之間的靜電排斥作用,從而導(dǎo)致金納米粒子發(fā)生聚集。圖2A為不同濃度MAM加入金溶膠后顏色變化的光學(xué)照片,可以看出,隨著MAM濃度增大,Au納米溶膠顏色逐漸變紫,出現(xiàn)明顯聚集。圖2B為加入不同濃度MAM后的金納米粒子的紫外圖譜。從圖中可以看到,所制備的金納米粒子紫外吸收峰位置在526 nm處,與文獻(xiàn)報(bào)道的30 nm粒徑的金納米粒子吸收峰位置基本一致。加入MAM后,金溶膠的最大吸收峰降低,且在750 nm處出現(xiàn)新的吸收峰,隨著MAM的濃度逐漸增大,新吸收峰的高度逐漸增加,位置發(fā)生紅移,進(jìn)一步說(shuō)明加入MAM后能夠引起金溶膠的快速聚集。

Fig.1 The SERS approach is created simply by passing the aggregated MAM-Au colloid solution through a filter membrane using a syringe

Fig 2 (A) Visual colour change of Au NPs with the indicated concentrations of melamine.(B) The evolution of UV-vis absorbance spectra of Au NPs colloid with the melamine concentration from 0,0.05,0.1,1.0,10,50,to 100 mg/L

3.2 修飾納米粒子后PVDF微孔濾膜表面形貌表征

PVDF膜,膜基質(zhì)具有大表面積、高滲透性及高吸附性能等顯著優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于蛋白質(zhì)印跡、環(huán)境污水處理等領(lǐng)域。由圖3A可見(jiàn),PVDF膜表面均勻,可見(jiàn)微孔的存在。將一定量的三聚氰胺與金溶膠的混合溶液勻速推過(guò)PVDF膜后,流出溶液為無(wú)色,說(shuō)明金納米聚集體被截留在PVDF膜表面,如圖3B所示,高密度的納米金聚集體分布在纖維結(jié)構(gòu)表面,這也是后續(xù)能產(chǎn)生明顯SERS增強(qiáng)的原因。

Fig.3 SEM images of (A) bulk PVDF filter membrane and (B) showing the clustering of gold nanoparticles in the pores of the filter membrane

3.3 在溶液中和牛奶中檢測(cè)三聚氰胺

Fig.4 SERS spectra of (A) melamine in aqueous solution detected using filter SERS.(B) melamine from real milk samples detected using filter SERS.The percentages of melamine in milk were 100 mg/L,10 mg/L and 1 mg/L

通過(guò)三聚氰胺的水溶液樣品驗(yàn)證完該方法的檢測(cè)能力之后,我們選擇添加不同量三聚氰胺分子的新鮮牛奶作為實(shí)驗(yàn)樣品,完成了對(duì)實(shí)際樣品中三聚氰胺分子的含量分析。首先我們向4.5 mL新鮮牛奶中分別添加0.5 mL不同濃度(1000、100、10 mg/L)的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻后即得到100、10、1 mg/L三聚氰胺加標(biāo)牛奶樣品,將該牛奶樣品進(jìn)行離心處理后(以10000轉(zhuǎn)每分鐘的速度離心20分鐘),取上清液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的待測(cè)樣品。離心過(guò)程中,可將牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪等較大的生物分子分離出來(lái),以免這些大生物分子會(huì)在后續(xù)的檢測(cè)過(guò)程中吸附到PVDF膜表面,影響對(duì)三聚氰胺的SERS檢測(cè)。按照前面所述的操作方法,我們獲得了摻有不同量三聚氰胺的牛奶樣品的測(cè)試結(jié)果,如圖4B所示。三聚氰胺的特征峰的強(qiáng)度隨牛奶中的三聚氰胺的添加量的降低而減弱,根據(jù)三聚氰胺含量為1 mg/L的牛奶樣品的測(cè)量結(jié)果大于三倍空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差的原則,我們判斷該方法對(duì)牛奶中三聚氰胺的SERS分析的檢測(cè)限可以達(dá)到1 mg/L。這一檢測(cè)限正好符合2011年由國(guó)家工商行政管理局和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局聯(lián)合頒布的關(guān)于食品中三聚氰胺含量規(guī)范的公告：“嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg,其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg,高于上述限量的食品一律不得銷售”。

4 結(jié)論

本文建立了一種簡(jiǎn)單快速的牛奶中三聚氰胺檢測(cè)的方法。以PVDF微孔濾膜為載體,采用簡(jiǎn)單過(guò)濾的方法將三聚氰胺誘導(dǎo)的金納米聚集體截留在PVDF膜表面,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的痕量SERS檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,由于微孔濾膜固有的吸附富集性能,對(duì)牛奶中痕量三聚氰胺具有較好的檢出,檢測(cè)限可以達(dá)到1 mg/L,滿足大部分國(guó)家規(guī)定的嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg的參考標(biāo)準(zhǔn)。由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不需要繁瑣的提取和分離步驟,大大的減少了對(duì)三聚氰胺的測(cè)試時(shí)間,表明該方法將在現(xiàn)場(chǎng)痕量分析方面具有較大應(yīng)用潛力。

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Rapid Detection of Melamine in Milk by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with PVDF Membranes as Supports

ZENG Tian,CHEN Qian,JIANG Qian,ZHOU Ji*,YE Yong

(HubeiCollaborativeInnovationCenterforAdvancedOrganicChemicalMaterials,MinistryofEducationKeyLaboratoryfortheSynthesisandApplicationofOrganicFunctionMolecules,HubeiUniversity,Wuhan430062,P.R.China)

We demonstrate an extremely simple and practical surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) technique for trace melamine detection in milk with PVDF(Polyviny Lidene Fluoride) membranes as supports.Through trisodium citrate reduction method,gold nanoparticles with average diameter of 30 nm were obtained.Upon addition to trace-level melamine,gold nanoparticle solution exhibits a highly sensitive colour change from red to blue and rapid aggregation behavior within several minutes.The SERS detection platform was constructed after trapping the mixture of aggregates and melamine on PVDF membrane through a simple filter-based approach,and the lowest detectable concentration was 0.05 mg/L in aqueous solution.Moreover,for the melamine-spiked milk samples,the lowest detectable concentration was 1 mg/L,which could meet the requirement accepted by most countries that the threshold in infant formula was 1 ppm.Thus,due to the simple procedure,the low-cost of the substrates and the short total analysis time,our technique enables SERS to be practical for a broad range of analytical applications,including field-based detection of toxins in large volume samples.

surface enhanced Raman spectroscopy；PVDF membrane；Au nanoparticle；melamine

2015-07-15; 修改稿日期:2015-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(21003034)；湖北省教育廳團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(T201101)；湖北省教育廳青年人才項(xiàng)目(Q20131002)

曾甜(1990-),碩士,主研方向：表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué) E-mail：852673807@qq.com

周吉,E-mail：zhouji@hubu.edu.cn

1004-5929(2016)03-0209-05

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10.13883/j.issn1004-5929.201603003