李冰潔

【摘要】 目的：通過對(duì)生產(chǎn)疫苗所用的細(xì)胞系進(jìn)行的致腫瘤原性實(shí)驗(yàn)，確定160代以內(nèi)的Vero細(xì)胞可安全用于生產(chǎn)。方法：用Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞接種裸鼠，觀察腫瘤的發(fā)生情況。結(jié)果：Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射部位、肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發(fā)生；Hela細(xì)胞對(duì)照組的10只裸鼠全部有腫塊形成，致癌致瘤率為10/10（100%）。結(jié)論：Vero細(xì)胞系非致瘤性細(xì)胞系，符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求，其在160代以內(nèi)可安全用于疫苗生產(chǎn)。

【關(guān)鍵詞】 Vero細(xì)胞； Hela細(xì)胞； 腫瘤原性； 研究

中圖分類號(hào) R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2016）28-0157-02

作為生物制品研究與生產(chǎn)的重要原材料，傳代細(xì)胞系的株系特征，特別是其致腫瘤性，不僅直接影響到疫苗的質(zhì)量，而且關(guān)系到人畜的健康與安全，因此一直被生物制品研究與生產(chǎn)部門所重視。生產(chǎn)疫苗所用細(xì)胞系應(yīng)無外源因子污染，符合細(xì)胞遺傳學(xué)要求，尤其應(yīng)在生產(chǎn)所使用的細(xì)胞代次內(nèi)無致腫瘤性，這才能符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求。筆者在建立傳代Vero細(xì)胞種子庫與工作庫基礎(chǔ)上，對(duì)研制生產(chǎn)疫苗所用的Vero細(xì)胞系160代進(jìn)行了致腫瘤原性實(shí)驗(yàn)，以確定160代以內(nèi)的Vero細(xì)胞可安全用于生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：非洲綠猴腎Vero細(xì)胞，160代（沈陽安迪生物高科技公司）；人宮頸癌Hela細(xì)胞S-3株，13代（中國藥品生物制品檢定所細(xì)胞室）；（2）裸鼠：Balb/C無胸腺雌性裸鼠20只，約4周齡（中國藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞制備 Vero細(xì)胞160代，250 ml細(xì)胞瓶，Hela細(xì)胞

13代4瓶，用胰酶消化，用無牛血清的Eagles MEM吹下、50 ml離心管1000 r/min，離心10 min，棄上清，加35 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，1000 r/min，離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用滅菌PBS洗1次，用1.5 ml PBS再洗1次，用1.5 ml PBS重懸細(xì)胞，取

0.1 ml，100倍稀釋，細(xì)胞計(jì)數(shù)，再將細(xì)胞濃度調(diào)到1.0×108/ml，Hela細(xì)胞為1.5 ml，Vero細(xì)胞為1.5 ml。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組每只裸鼠頸部皮下注射0.1 ml Hela細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠頸下皮下注射0.1 ml Vero細(xì)胞，細(xì)胞濃度均為1.0×108/ml，各注射10只；每周觀察記錄1次裸鼠狀態(tài)、體重及注射部位變化，觀察30 d，而后將裸鼠處死，解剖，用10%中性緩沖福爾馬林固定裸鼠肺、肝、頸部接種部位組織，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察[1-2]。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠中有3只注射部位變紅，對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑0.4～0.6 cm的結(jié)節(jié)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加，對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑1.0～1.5 cm的結(jié)節(jié)，有2只結(jié)節(jié)中央有0.3～0.5 cm的潰瘍發(fā)生。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行21 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加，對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑1.0～2.0 cm的結(jié)節(jié)，其中2只裸鼠結(jié)節(jié)中央有0.5～0.8 cm的潰瘍發(fā)生，2只裸鼠死亡。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加，對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)1.0～2.0 cm的結(jié)節(jié)，有2只結(jié)節(jié)中央有0.5～1.0 cm的潰瘍發(fā)生。

2.2 病理變化

通過顯微鏡病理切片檢查，實(shí)驗(yàn)組（注射Vero細(xì)胞）的10只裸鼠注射部位未見異常、狀態(tài)良好、體重有增加，皮下組織、肺部組織、肝臟組織的病理切片均未見腫瘤組織發(fā)生；對(duì)照組（注射Hela細(xì)胞）剩余的8只裸鼠注射部位均見腫瘤發(fā)生，肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發(fā)生（見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6）。

圖1 對(duì)照組頸部腫物的病理切片 圖2 實(shí)驗(yàn)組接種部位皮下組織病理

切片

注：圖1，Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月頸部腫物的病理切片，未見腫瘤組織。圖2，Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月接種部位皮下組織病理切片，未見腫瘤組織

圖3 對(duì)照組肝臟組織病理切片 圖4 實(shí)驗(yàn)組肝臟組織病理切片

注：圖3，Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肝臟組織病理切片，未見腫瘤組織。圖4，Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肝臟組織病理切片，未見腫瘤組織

圖5 對(duì)照組肺部組織病理切片 圖6 實(shí)驗(yàn)組肺部組織病理切片

注：圖5，Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肺部組織病理切片，未見腫瘤組織。圖6，Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肺部組織病理切片，未見腫瘤組織

3 討論

裸鼠先天性胸腺缺失，胸腺依賴性免疫功能缺乏，T或B淋巴細(xì)胞功能完全缺乏，異種移植時(shí)不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，所以國內(nèi)外許多學(xué)者多選用裸鼠作為異種動(dòng)物組織、細(xì)胞的移植和人類腫瘤異種動(dòng)物組織、細(xì)胞的移植和人類腫瘤異種移植的首選對(duì)象。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的10只裸鼠注射部位肺、肝均未見腫瘤性病變，致癌致瘤率為零；Hela細(xì)胞對(duì)照組的10只裸鼠全部有腫塊形成，致癌致瘤率為10/10（100%）。Hela細(xì)胞對(duì)照組的裸鼠在注射部位均有直徑1～2 cm大小的腫瘤發(fā)生。腫瘤中央有0.5～1.0 cm的潰瘍發(fā)生，解剖內(nèi)臟，肺無明顯肉眼病變，肝臟有肉眼可見病變發(fā)生，肝腫大，表面有呈針尖大小多凸起病變發(fā)生，但除注射部位有惡性腫瘤發(fā)生外，肺及肝組織未見腫瘤性病變。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Vero細(xì)胞系非致瘤性細(xì)胞系，符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求，其在160代以內(nèi)可安全用于疫苗生產(chǎn)。所以，在采用Vero細(xì)胞進(jìn)行疫苗生產(chǎn)過程中，要保障產(chǎn)品的安全性[3]，很有必要建立一個(gè)經(jīng)過檢定的、低代次的細(xì)胞種子庫，并且在可能的情況下，對(duì)更高代次的Vero細(xì)胞進(jìn)行檢定，以確保細(xì)胞種子庫的安全性及生產(chǎn)的需要。

近年來，Vero細(xì)胞作為連續(xù)細(xì)胞系在我國越來越多地用于病毒性疫苗的生產(chǎn)[4]，檢測(cè)方法也在不斷更新中[5]，并且在發(fā)達(dá)國家病毒疫苗生產(chǎn)的主要工藝技術(shù)是Vero細(xì)胞的微載體固定化培養(yǎng)，這也是目前我國致力于建立和完善的病毒疫苗生產(chǎn)技術(shù)[6]。隨著對(duì)疫苗質(zhì)量和安全性要求的不斷提高，用無血清培養(yǎng)基取代含血清培養(yǎng)基Vero細(xì)胞已成為病毒疫苗生產(chǎn)的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)[7]，但商業(yè)化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基還存在諸如培養(yǎng)基大多以液體的形式提供，價(jià)格昂貴等問題[8]，這在很大程度上限制了Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基在病毒疫苗生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用[9]。因此，用傳統(tǒng)的方法，開發(fā)更高代次的Vero細(xì)胞系仍是今后需要努力的方向。

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（收稿日期：2016-06-22）