張穎 王金良

（山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院 256600）

兔病毒性出血癥病毒分離和鑒定

張穎 王金良

（山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院 256600）

從疑似感染兔病毒性出血癥病毒的病兔體內(nèi)分離到1株病毒，病兔表現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、全身實(shí)質(zhì)臟器出血等典型病變。取病兔肝臟做血凝和血凝抑制試驗(yàn)，分離毒株可以凝集1.0%人 “O”型紅細(xì)胞，可以被兔病毒性出血癥病毒陽(yáng)性血清中和，對(duì)家兔的LD50為10-6.75/ml，是一株對(duì)家兔具有高致病力的強(qiáng)毒株，對(duì)分離毒株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，說(shuō)明該病兔感染了兔病毒性出血癥病毒，本病毒的成功分離和鑒定為發(fā)病兔場(chǎng)找到了致病原，為兔瘟疾病的診斷和防制提供了參考。

兔病毒性出血癥病毒；分離；鑒定

兔病毒性出血癥 （Rabbit viral hemorrhagic disease，RHD）是一種急性高度接觸性傳染病，病原為兔病毒性出血癥病毒（Rabbit viral hemorrhagic disease viruses，RHDV），各品種和不同性別的兔均易感，該病主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、實(shí)質(zhì)臟器水腫、淤血及出血性變化[1，2]。該病于1984年在我國(guó)江蘇省江陰縣首次暴發(fā)[3]，隨后廣泛流行于世界各地[4.5]，目前該病呈世界范圍內(nèi)流行，每年都給全球養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也是目前危害我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展的頭號(hào)殺手[6]。2016年3月，山東省濰坊市某兔場(chǎng)發(fā)生了一起以體溫升高、食欲下降、鼻孔流血、氣管出血、肝臟出血為主要特征的疫病，為對(duì)兔場(chǎng)此次疫病進(jìn)行確診，獲得病原體豐富本單位生物資源及為相應(yīng)的疫苗研制奠定基礎(chǔ)，筆者對(duì)該兔場(chǎng)進(jìn)行了兔病毒性出血癥病毒的分離和鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 臨床癥狀

發(fā)病兔表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、呼吸困難、呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死并出血等典型癥狀，采集病兔的肝臟作為接種病料樣品。

1.2 試劑、血清、紅細(xì)胞、試驗(yàn)動(dòng)物

Taq酶、DL 2000 Mrker、膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程 （上海）股份有限公司；兔病毒性出血癥病毒陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；人“O”型紅細(xì)胞由濱州市中心血站饋贈(zèng)；新西蘭白兔購(gòu)自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 病料的處理

采集病兔的肝臟用滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，制成10%乳劑，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離

將處理好的病料樣品頸部皮下注射體重為2.0kg健康新西蘭白兔5只，每日觀察試驗(yàn)兔的臨床癥狀，兔死亡后迅速剖檢并觀察病理變化，無(wú)菌采集死亡兔的病變組織樣品按上述方法再傳2代。

1.5 血凝試驗(yàn)

采用微量法測(cè)定分離毒株對(duì)1.0%人 “O型”紅細(xì)胞的凝集性。

1.6 中和試驗(yàn)

將分離毒株與等量抗兔病毒性出血癥病毒陽(yáng)性血清混勻，37℃中和反應(yīng)1h后做血凝試驗(yàn)。

1.7 毒力試驗(yàn)

用滅菌生理鹽水將分離株病毒依次作10倍系列稀釋，取每個(gè)稀釋度分別頸部皮下注射健康新西蘭白兔5只，1.0ml/只，計(jì)算分離毒株對(duì)家兔的LD50。

1.8 RT-PCR鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)兔病毒性出血癥病毒特異性檢測(cè)引物 （P1:5'-CGTGC TTCAGTTTTGGTA-3'；P2:5'-ATGAGTGCTGACGAGTAG-3'），引 物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。按照參考文獻(xiàn)[7]中兔病毒性出血癥病毒RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行分離毒株的PCR檢測(cè)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程 （上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

組織病料樣品連續(xù)傳代3次均對(duì)家兔具有高致病性，攻毒家兔均100%死亡，死亡兔表現(xiàn)出鼻孔出血、尸體僵直等臨床癥狀，剖檢觀察可見氣管出血，呈現(xiàn) “紅氣管”特征，肝臟、脾臟、腎臟、心臟等實(shí)質(zhì)臟器出血、瘀血、腫大。無(wú)菌收集第3代分離株病毒，命名為WF株，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血凝性的測(cè)定結(jié)果

微量法測(cè)定WF株病毒對(duì)人 “O”型紅細(xì)胞的凝集效價(jià)為1：1024。

2.3 中和試驗(yàn)結(jié)果

WF株病毒與等量抗兔病毒性出血癥病毒陽(yáng)性血清37℃中和反應(yīng)1h后對(duì)人 “O”型紅細(xì)胞無(wú)凝集效價(jià)，WF株病毒的血凝作用被抑制，證實(shí)分離毒株為兔病毒性出血癥病毒。

2.4 毒力試驗(yàn)結(jié)果

按Reed-Muench法測(cè)定WF株病毒對(duì)家兔的LD50為10-6.75/ml，分離毒株具有較強(qiáng)的毒力。

2.5 PCR鑒定結(jié)果

按照參照文獻(xiàn)[7]的方法，WF株病毒可擴(kuò)增出586bp目的條帶 （見附圖），與預(yù)期大小相一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程 （上海）股份有限公司測(cè)序鑒定為兔病毒性出血癥病毒VP60基因特異性序列，從分子水平鑒定為該病兔發(fā)生了兔病毒性出血癥病毒感染。

3 討論

本研究從疑似感染兔病毒性出血癥病毒的病兔體內(nèi)分離到1株兔病毒性出血癥病毒。該病毒與1.0%人 “O”型紅細(xì)胞做微量血凝試驗(yàn)陽(yáng)性，利用兔病毒性出血癥病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清可以中和分離的兔病毒性出血癥病毒。病毒分離是疾病診斷的可靠方法，為了對(duì)病毒分離結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，本研究還進(jìn)行了分子生物學(xué)PCR檢測(cè)，通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定說(shuō)明，分離毒為兔病毒性出血癥病毒的特異序列，為病兔發(fā)生兔病毒性出血癥病毒感染提供有力的診斷依據(jù)。通過(guò)對(duì)兔病毒性出血癥病毒的分離鑒定，為兔病毒性出血癥病毒相關(guān)疾病的診斷提供參考，也為本實(shí)驗(yàn)室研制安全、高效的RHD疫苗奠定了基礎(chǔ)。

附圖 PCR擴(kuò)增結(jié)果

兔場(chǎng)發(fā)生兔病毒性出血癥病毒感染后，對(duì)發(fā)病兔采取緊急隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒，糞、墊草和污物集中銷毀，兔群進(jìn)行兔病毒性出血癥疫苗的緊急免疫接種，對(duì)器具、水槽和飼料槽用消毒藥浸泡、清洗和消毒。本病的發(fā)生與飼養(yǎng)場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境不良有很大關(guān)系，飼養(yǎng)密度過(guò)大，通風(fēng)不良，兔舍陰暗潮濕，兔病毒性出血癥疫苗免疫接種不及時(shí)等有很大關(guān)系，通過(guò)對(duì)本病的診治，提高了養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)本病的重視，改善了兔場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境，兔病毒性出血癥的發(fā)病情況得到有效控制。

[1]譚永貴,繆秋紅,吳巧梅,等.新型兔出血癥病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2016,24(1):80-86.

[2]汪亮.兔病毒性出血癥的流行、診斷及防控[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2015(10):12-13.

[3] 劉勝江,薛華平,蒲伯清,等.兔的一種新病毒病-兔病毒性出血癥[J].畜牧與獸醫(yī),1984（6):253-255.

[4]Mitro S,Krauss H.Rabbit hemorrhagic disease:a review withspecialreference to its epizootiology[J].Eur J Epldemio,1993,9(1):70-78.

[5]Nowotny N,Ros Bascunana C,Ballagi-Pordany A,et al.Phylo-geneifc analysis of rabbithaemorrhagic disease and European brownhare Syndrome viruses by comparison of sequences fromthe capsidprotein gene[J].Arch Virol,1997,142(4):657-673.

[6]曹德祥,白玫.兔病毒性出血癥的流行癥狀以及防控措施[J].山東畜牧獸醫(yī),2015(1):49.

[7]程漢,曹軍平,包祥嘉.兔出血癥病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(4):191-193.

張穎 （1975.6-)，女，助理研究員，研究方向：生物制劑。