馬增暉 （河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局 064400)

家兔支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗菌種篩選

馬增暉 （河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局 064400)

兔波氏桿菌病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的細(xì)菌性疾病。兔波氏桿菌病可引起家兔的傳染性鼻炎，特別是在規(guī)模化養(yǎng)兔場(chǎng)，波氏桿菌與巴氏桿菌、葡萄球菌混合感染相當(dāng)普遍，已成為兔病防治的一大難題。接種疫苗是目前預(yù)防這兩種疾病的最有效的措施。本研究從Bb分離株中篩選得到制苗用兔波氏桿菌1株，為研制Bb滅活疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)將菌種的篩選及生物學(xué)特性的試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用菌株

Bb分離株6株；沙門氏菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌，均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

16～18g的清潔級(jí)小鼠；30日齡左右的健康家兔。

1.1.3 常規(guī)培養(yǎng)基

血清血紅素平板、TSA平板、膽硫乳 （DHL）平板、麥康凱平板、馬丁肉湯等 (按常規(guī)方法配制)。

1.1.4 生化培養(yǎng)基及試劑

蛋白胨水、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、葡萄糖磷酸鹽胨水、枸椽酸鹽培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵管、尿素培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。3%H2O2按照常規(guī)方法配制。

1.1.5 血清

Bb標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)小鼠的毒力測(cè)定

將6株Bb純培養(yǎng)物接種馬丁肉湯，置37℃搖動(dòng) （120r/min）培養(yǎng)24h。選擇16～18g小鼠分為6組，每組4只。以0.2ml/只腹腔注射，觀察3～5d，記錄小鼠死亡時(shí)間，死亡者剖檢，以分離到接種菌為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 最小致死劑量 (MLD)的測(cè)定

（1）對(duì)小鼠最小致死劑量測(cè)定。將3株Bb強(qiáng)毒株純培養(yǎng)物接種馬丁肉湯，置37℃搖動(dòng) （120r/min）培養(yǎng)24h。用平板培養(yǎng)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，據(jù)結(jié)果將菌體濃度調(diào)整為1×109CFU/ml。將小鼠隨機(jī)分3批，每批3組，每組2只，分別腹腔注射上述活菌1ml，0.1ml，0.01ml，另取6只小鼠分3批作對(duì)照，每批注射等量滅菌生理鹽水。觀察3～5d。詳細(xì)記錄小鼠死亡時(shí)間，并對(duì)死亡小鼠無菌取心血、肺，劃麥康凱平板于37℃溫箱培養(yǎng)。

（2）對(duì)家兔的最小致死劑量測(cè)定。將3株Bb強(qiáng)毒株純培養(yǎng)物分別用接種環(huán)挑取菌落劃滿血清血紅素平板，置37℃培養(yǎng)24h，用馬丁肉湯洗下，計(jì)數(shù)，把菌液濃度調(diào)整為2×1010CFU/ml。將家兔隨機(jī)分3批，每批4組，每組4只，分別靜脈注射上述活菌2ml，1ml，0.5ml，0.25ml，另取6只家兔分3批作對(duì)照，每批注射等量滅菌生理鹽水。接種后，各組隔離飼養(yǎng)，觀察7d。詳細(xì)記錄家兔死亡時(shí)間，并對(duì)死亡家兔無菌取心血、肺劃麥康凱平板，置37℃溫箱培養(yǎng)觀察。

1.2.3 血清學(xué)交互試驗(yàn)

（1）細(xì)菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。將3株Bb強(qiáng)毒株分別接種到血清血紅素平板上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，純檢，用接種環(huán)挑取菌落劃滿血清血紅素平板，37℃培養(yǎng)24h，純檢，用馬丁肉湯洗下，計(jì)數(shù)，把菌液濃度調(diào)整為2.5×1010CFU/ml，加入0.2%的甲醛溶液滅活24h，滅活檢驗(yàn)合格后分為兩份備用。

（2）免疫原制備。取檢驗(yàn)合格的菌懸液1份，加20%的滅活鋁膠佐劑，調(diào)整菌液最終濃度為2×1010CFU/ml，4℃冰箱中保存，作為免疫原使用。

（3）微量凝集抗原制備。取另1份菌懸液，先用生理鹽水洗滌3次。每次用生理鹽水混勻，10000r/min離心20min，直至上清液清澈為止，棄去上清液。取沉淀用生理鹽水稀釋至1.2×1010CFU/ml，在懸濁液內(nèi)添加甲醛，使其最終濃度為0.3%。在4℃環(huán)境下慢慢振蕩，滅活4h。按1/10000比例添加硫柳汞后，在4℃冰箱中冷藏保存，作為微量凝集抗原原液使用。使用時(shí)，用生理鹽水稀釋至3×109CFU/ml。

（4）兔Bb高免血清的制備：經(jīng)血清平板凝集試驗(yàn)檢查為Bb抗體陰性的健康家兔6只，分別用上述抗原免疫，每株細(xì)菌免疫2只家兔，共免疫3次，每次間隔1周，免疫菌體的量依次為0.5ml、1ml、1ml。末次免疫后7d試血，待兔血清微量凝集價(jià)高于1:256時(shí)心臟采血、分離血清。分別用接種環(huán)挑取沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、魏氏梭菌平板培養(yǎng)物各1環(huán)，與血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，檢測(cè)特異性，合格者分裝置-20℃保存。

（5）微量凝集試驗(yàn)：Bb強(qiáng)毒菌株抗原分別與上述高免血清進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)，選取交叉反應(yīng)性最好的菌株作為制苗用菌株。試驗(yàn)設(shè)陽性血清和陰性血清對(duì)照。

1.2.4 3株Bb強(qiáng)毒株對(duì)小鼠交互免疫保護(hù)試驗(yàn)

（1）交互免疫保護(hù)試驗(yàn)免疫原的制備。參照1.2.3中免疫原的制備。

（2）交互免疫保護(hù)試驗(yàn)方法。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射上述免疫原0.3ml，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量滅菌生理鹽水。15d后以24h內(nèi)致死小鼠劑量攻毒，記錄結(jié)果，選取保護(hù)率最高的Bb疫苗菌株作為制苗用菌株。

1.2.5 對(duì)制苗用兔支氣管敗血波氏桿菌菌株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠的毒力測(cè)定

將分離菌馬丁肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小鼠后，3d內(nèi)小鼠幾乎全部死亡。據(jù)具體死亡時(shí)間 （見表1），從6株Bb中篩選出3株最強(qiáng)菌株，菌種編號(hào)分別為 AH0702，HN0701，SD0612。從死亡小鼠心臟、肺臟均能分離到與接種菌一致的病原菌。

2.2 最小致死劑量 (MLD)的測(cè)定

3株Bb強(qiáng)毒株對(duì)小鼠及家兔的最小致死劑量 (見表2)。3株Bb強(qiáng)毒株對(duì)小鼠的最小致死劑量都是0.01ml(菌液濃度1×109CFU/ml)，對(duì)家兔的最小致死劑量分別為0.25ml，0.5ml，0.25ml(菌液濃度2×1010CFU/ml)。 其中SD0612和AH0702株MLD最低，再通過對(duì)SD0612和AH0702株MLD致死小鼠、家兔死亡時(shí)間上進(jìn)行比較，SD0612株Bb毒力最強(qiáng) （見表3、4）。從死亡小鼠、家兔心臟、肺臟均能分離到接種菌。

2.3 血清學(xué)交互試驗(yàn)

試驗(yàn)中制備的上述3株Bb的高免血清與對(duì)照菌株均無凝集反應(yīng)，因此，這3株血清均具有種屬特異性。用這些血清對(duì)Bb的3株強(qiáng)毒株進(jìn)行血清學(xué)交叉反應(yīng)時(shí)，如表5所示，3個(gè)菌株都可發(fā)生交互凝集。SD0612株的交叉反應(yīng)性最好，其高免血清與3個(gè)毒株發(fā)生的凝集反應(yīng)凝集效價(jià)都非常高；AH0702、HN0701株次之。

2.4 3株Bb強(qiáng)毒株對(duì)小鼠交互免疫保護(hù)試驗(yàn)

在用這3個(gè)菌株進(jìn)行小鼠的交互免疫保護(hù)試驗(yàn)時(shí)，SD0612株抗原對(duì)3株Bb強(qiáng)毒攻擊的總保護(hù)率最高 (見表6)，與血清學(xué)交互試驗(yàn)完全符合，故將其作為制苗用菌株。

2.5 兔支氣管敗血波氏桿菌SD0612株的生物學(xué)特性

2.5.1 形態(tài)及生化特性

本菌為革蘭氏陰性，球桿菌，兩端鈍圓，散在，少數(shù)成雙存在，兩極染色不明顯。生化試驗(yàn)結(jié)果為不發(fā)酵葡萄糖等碳水化合物，不產(chǎn)生靛基質(zhì)、硫化氫；M-R試驗(yàn)為陰性；V-P試驗(yàn)陽性；分解尿素；不能利用枸椽酸鈉，還原硝酸鹽。

2.5.2 血清型

與SD0612株的高免血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果均呈陽性反應(yīng)；在血平板上生長(zhǎng)呈β溶血且致死小鼠，說明SD0612株是I相菌。

表1 分離菌對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn)結(jié)果

表2 3株Bb對(duì)小鼠、家兔的MLD測(cè)定結(jié)果

表3 對(duì)小鼠的最小致死劑量 (MLD)測(cè)定結(jié)果

表4 對(duì)家兔的最小致死劑量 (MLD)測(cè)定結(jié)果

表5 血清學(xué)交叉反應(yīng)結(jié)果

2.5.3 菌落型

將菌種接種于TSA平板上培養(yǎng)24h，菌落呈淡黃色、直徑0.5～1mm、表面隆起、濕潤(rùn)、光滑、透明、有光澤。在膽硫乳 （DHL）平板上則形成直徑為2mm左右，無色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)30h，菌落呈茶黃色、直徑1～2mm，表面隆起、濕潤(rùn)、光滑、透明、有光澤，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色。鮮血平板上24h形成1mm左右乳白色菌落，菌落周圍有β溶血圈，菌落濕潤(rùn)，中心隆起，邊緣整齊。

表6 3株Bb強(qiáng)毒株交互免疫保護(hù)試驗(yàn)

2.5.4 菌株毒力

SD0612株0.01ml(菌液濃度1×109CFU/ml)活菌腹腔注射16～18g的小鼠，小鼠于3d內(nèi)死亡。

2.5.5 免疫原性

用16～18g小鼠10只，腹腔注射以20%鋁膠生理鹽水稀釋的SD0612株滅活菌液0.3ml(含活菌60億)，15d后，連同條件相同的對(duì)照鼠10只，腹腔注射SD0612株3MLD，觀察7d。結(jié)果，注射3MLD的對(duì)照小鼠全部死亡，免疫鼠有8只獲得保護(hù)。

3 討論與小結(jié)

Ⅰ相菌有不耐熱的莢膜和短鞭毛，具有強(qiáng)壞死毒素，對(duì)小鼠和家兔有高度的致病性。而Ⅱ相菌和Ⅲ相菌則無致病性。據(jù)此，通過對(duì)小鼠的毒力測(cè)定，對(duì)小鼠，家兔的最小致死劑量的測(cè)定，血清學(xué)交互反應(yīng)和小鼠交互免疫保護(hù)試驗(yàn)，并對(duì)SD0612株進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定，結(jié)果表明，該菌株毒力較強(qiáng)，免疫原性好。故選擇SD0612株作為制苗用菌種。