陳春

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

牛膝多糖體外對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的研究

陳春

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

本試驗(yàn)研究牛膝多糖（ABP）體外對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響。在培養(yǎng)體系中分別添加不同濃度的ABP（0，100，200，300，400，500ug/mL），采用四唑鹽（MTT）法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果表明：不同濃度的ABP均能直接顯著促進(jìn)豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且其作用有一定的劑量依賴關(guān)系。

牛膝多糖；外周血淋巴細(xì)胞；豬

牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharide，ABP）是從牛膝根(Achyranthes bidentata B1)中提取、分離、純化得到的一種小分子水溶性的多糖化合物。近年來國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)ABP進(jìn)行大量的研究，結(jié)果表明，ABP是一種免疫調(diào)節(jié)劑,具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和多種免疫調(diào)節(jié)作用。但是有關(guān)ABP對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響報(bào)道較少，外周血淋巴細(xì)胞增殖是反應(yīng)動(dòng)物細(xì)胞免疫的一個(gè)重要指標(biāo)，測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖效果是研究機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要手段之一。通過ABP直接對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步開展ABP提高仔豬免疫功能的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及材料胎牛血清；淋巴細(xì)胞分離液；RPMI-1640培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，0.22μm微孔濾膜抽濾器；其它試劑均為分析純；牛膝多糖（含多糖97%）。

1.1.2 主要試劑的配制D－Hank’s平衡鹽：分別稱取8.00g NaCl、0.40g KCl、0.06g KH2PO4、0.35gNaHCO3、0.08g Na2HPO4·H2O、1.00g葡萄糖，加入三蒸水1000mL溶解，調(diào)pH至7.2～7.4，8磅15 min高壓蒸汽消毒滅菌，冷卻后無菌條件下分裝，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆酶邏合荆庞?℃冰箱中保存?zhèn)溆弥饌€(gè)溶解于800mL蒸餾水中。

肝素抗凝劑：稱取7.15mg肝素鈉粉末，溶于10mL生理鹽水中，抽濾即得10 000U/mL母液。

抗菌素液（雙抗）：稱取青霉素鈉62.5mg（160IU/mg），硫酸鏈霉素鈉100mg，溶于10mL滅菌的Hank’s液中，抽濾，得到含青霉素、鏈霉素分別為10000IU/mL和10000μg/mL的雙抗母液。

4%的臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100mL，用濾紙過濾，4℃保存。使用時(shí)用PBS稀釋至0.4%。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基：87%RPMI-1640+1%雙抗母液＋10%胎牛血清，用5.6%的無菌NaHCO3調(diào)其pH至7.2～7.4。

四唑鹽（MTT）溶液（5mg/mL）：50mg MTT，用10mL三蒸水溶解，抽濾；PHA母液（500μg/mL）：5mgPHA，用10mL RPMI-1640溶解，抽濾，分裝備用；甲瓚裂解液：于200mL體積分?jǐn)?shù)為50%二甲基甲酰胺（DMF）溶液中緩慢加入十二烷基硫酸鈉（SDS）28g，磁力攪拌器充分溶解后，普通濾紙過濾，用pH調(diào)節(jié)混合液調(diào)pH至4.7。

1.1.3 主要儀器酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，倒置顯微鏡, 5%CO2培養(yǎng)箱，立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)選取一頭體重約10kg的健康杜×長(zhǎng)×大，前腔靜脈采血，分離淋巴細(xì)胞，然后按以下設(shè)計(jì)進(jìn)行體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組（100μg/mLABP，200μg/mLABP，300μg/mLABP，400μg/mLABP，500 μg/mLABP，空白組設(shè)6個(gè)組，每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.2.2 采用MTT法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖

1.2.2.1 分離外周血淋巴細(xì)胞取肝素抗凝血（含肝素20U/mL）10mL，與等量的D-Hank’s液混勻，按1:1緩慢加于淋巴細(xì)胞分離液上，25℃2500r/min離心20min，吸取中間白細(xì)胞層，然后按1mL血加5 mL紅細(xì)胞裂解液，靜置5min，1500r/min離心10 min，棄上清，再用D-Hank’s洗滌2次，棄上清，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%雙抗）洗滌1次，離心，棄上清，最后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基吹打成懸液。

1.2.2.2 淋巴細(xì)胞成活率測(cè)定及細(xì)胞計(jì)數(shù)

（1）計(jì)數(shù)板：用無水酒精或95%酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。把蓋玻片覆蓋在計(jì)數(shù)板上，使之微微移向一側(cè)，露出計(jì)數(shù)板面少許，以滴加細(xì)胞懸液。

（2）染色：取吸管1支，深入淋巴細(xì)胞懸液中，輕輕反復(fù)吹打淋巴細(xì)胞懸液，使淋巴細(xì)胞重懸均勻后，立即吸取淋巴細(xì)胞懸液少許，向另一干凈離心管內(nèi)滴入細(xì)胞懸液9滴，再滴入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液1滴，混勻，放置2～3min。

（3）加懸液：把計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡臺(tái)上，立即從計(jì)數(shù)板邊緣輕輕滴入1～2滴已染色的細(xì)胞懸液，使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片間隙。

（4）計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方，不計(jì)右側(cè)和下方。

（5）計(jì)算：原細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）=

（6）鏡下觀察細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼藍(lán)染液的排斥情況：細(xì)胞胞體透亮的，表明其活力良好；細(xì)胞胞體藍(lán)染的，則視為死亡。在鏡下數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活力良好的百分比，細(xì)胞活力大于95%者用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2.3 淋巴細(xì)胞的接種培養(yǎng)及MTT法測(cè)定通過計(jì)數(shù)得知懸液中淋巴細(xì)胞數(shù)后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL，除空白組外，每孔加入淋巴細(xì)胞懸液50μL，然后按試驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔分別加入含不同濃度ABP，即每孔最終體積為100μL，最終細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，空白調(diào)零其它每孔加入100μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基。置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)44h。每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，然后每孔加入100μL 14%SDS-50%DMF溶液，繼續(xù)孵育2h，選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，即OD570。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS（V8）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了單因子方差分析，經(jīng)單因子方差分析差異性顯著的再利用LSD法進(jìn)行多重比較，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

表1 ABP對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

通過MTT試驗(yàn)測(cè)出外周血淋細(xì)胞在5種不同濃度牛膝多糖中的吸光度值如表1，各濃度組與對(duì)照組比較,可以看出細(xì)胞中添加牛膝多糖均不同程度的促進(jìn)外周血淋細(xì)胞的增值（P＜0.0001）。5個(gè)牛膝多糖組除了200μg/mLABP組外，基本上是隨著ABP的增加，外周血淋巴細(xì)胞增殖加強(qiáng)。

3 討論

淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要評(píng)判指標(biāo)，大量的研究表明ABP能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，李宗楷等研究發(fā)現(xiàn)ABP能提高老年鼠T淋巴細(xì)胞的增殖。陳清華等研究ABP添加在飼糧中，可以顯著提高仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。季敬璋等發(fā)現(xiàn)ABP能誘導(dǎo)人T細(xì)胞分泌γ干擾素（IFN-γ），并有一定的量效和時(shí)效關(guān)系。邱妍等研究報(bào)道ABP能促進(jìn)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)試驗(yàn)組有4個(gè)組隨著ABP量的增加（P＜0.05），外周淋巴細(xì)胞的增殖逐漸加大。但除第2組例外，沒有顯著變化，需進(jìn)一步研究。表明ABP能促進(jìn)豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖，提高免疫力作用。并存一定的劑量關(guān)系。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，牛膝多糖對(duì)外周血淋細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，且呈非典型的劑量依賴關(guān)系；最佳的劑量關(guān)系需待進(jìn)一步的研究。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：54.

［2］張?jiān)品?，?牛膝多糖的生物學(xué)功能研究進(jìn)展［J］.牧獸醫(yī)雜志，2007，6（4）:27－29.

［3］陳洪亮.植物多糖的制備及對(duì)肉仔雞免疫功能影響的研究［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002.

［4］金海麗，等.多糖抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)飼料，2002，（9）:5-7.

［5］盧杏通，等.多糖類免疫調(diào)節(jié)劑研究概況［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（1）:10-12.

［6］李宗楷，等.牛膝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1997，32（12）:881-887.

［7］陳清華.牛膝多糖對(duì)豬的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)和免疫調(diào)空機(jī)理研究［D］.博士學(xué)位論文，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙.2008，83-89.

［8］季敬璋，等.牛膝多糖體外誘導(dǎo)人T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和IL-4的機(jī)制探討閉［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003，19（9）:611-613.

［9］邱妍，等.4種多糖對(duì)免疫雛雞抗體效價(jià)和T淋巴細(xì)胞的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）:77-81.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．01.006

陳春（1985～），廣西人，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理