朱慶鋒，王志林，崔百元，張 琪，陳 莊，晏石娟，貝錦龍*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因中心，廣州 510640； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物科學(xué)研究所，廣州 510640)

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糖基化影響真菌植酸酶的胰蛋白酶耐受性

朱慶鋒1，王志林2，崔百元1，張 琪1，陳 莊1，晏石娟1，貝錦龍1*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因中心，廣州 510640； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物科學(xué)研究所，廣州 510640)

通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，將黑曲霉植酸酶(AspergillusnigerNRRL 3135 phytase)第238～337位與第382～444位多肽片段的基因編碼序列替換為煙曲霉植酸酶(AspergillusfumigatusATCC 13073 phytase)中的對應(yīng)序列，構(gòu)建片段置換植酸酶(Fragments-replaced phytase)基因.將插入該基因的pGAPZα A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母.通過離子交換與凝膠過濾純化，獲得重組酵母分泌的活性片段置換植酸酶.與黑曲霉植酸酶相比，片段置換顯著提高了片段置換植酸酶的胰蛋白酶耐受性.而通過脫糖基化酶PNGase徹底去除N-糖基化，可恢復(fù)片段置換植酸酶對胰蛋白酶的敏感性.上述結(jié)果表明煙曲霉植酸酶對應(yīng)片段上的N-糖基化修飾可顯著提高畢赤酵母表達(dá)的黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性.

植酸酶； 黑曲霉； 煙曲霉； 糖基化； 蛋白酶水解

由于缺乏內(nèi)源性植酸酶，單胃動物(如豬、雞等)無法直接釋放與利用植物籽實中與肌醇結(jié)合的磷酸.在飼料中添加微生物植酸酶，可促進(jìn)動物利用植物性飼料中的植酸磷，降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用與環(huán)境中的磷污染[1].目前飼料工業(yè)已廣泛應(yīng)用商品化外源性植酸酶替代部分無機磷，并取得顯著的經(jīng)濟與環(huán)境效益[2].

動物胃腸道環(huán)境復(fù)雜多變，除pH從酸性陡變?yōu)橹行酝?，還存在胃蛋白酶與胰蛋白酶等蛋白水解酶.而來源各異的植酸酶對不同蛋白酶的抗水解能力也不相同[3-4].為提升使用效率，理想的養(yǎng)殖業(yè)用植酸酶除高底物親和力、寬最適pH范圍、耐熱性等[5]外，還應(yīng)具有在動物消化道內(nèi)抵抗消化酶水解的特性[4].

來自黑曲霉(Aspergillusniger)NRRL 3135菌株的植酸酶(Anp)是最早得到應(yīng)用的一種商品植酸酶[6].2001年貝錦龍等[7]通過密碼子優(yōu)化等手段，在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)該酶.但與曲霉表達(dá)的耐胰蛋白酶不耐胃蛋白酶的黑曲霉植酸酶[3]不同，酵母表達(dá)的Anp對胃蛋白酶表現(xiàn)出極強的抵抗力，而對胰蛋白酶十分敏感[8].但通過畢赤酵母表達(dá)的另一種來自無花果曲霉(Aspergillusfumigatus)ATCC 13073菌株的植酸酶(Afp)，則完全不受胰蛋白酶的影響[8].陳莊等[9]發(fā)現(xiàn)在Afp中引入Anp片段可降低植酸酶對胰蛋白酶的耐受性.本研究則通過在Anp中引入Afp片段的策略，增加了Anp對胰蛋白酶的耐受性，并揭示了糖基化對真菌植酸酶胰蛋白酶耐受性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母X-33和質(zhì)粒pGAPZα A購自invitrogen公司(USA).PfuUltraTM高保真DNA聚合酶購自STRATAGENE公司(USA).所有限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司. Vivaspin超濾柱購自VIVASCIENCE公司(Germany).HiTrapTMSP柱、HiTrapTMQ柱和HiPrepTM26/60 Sephacryl S-200 HR柱購自Amersham Pharmacia Biotech公司 (Switzerland).Sequencing Grade Modified Trypsin 購自Promega公司(USA).PNGase F購自NEB(北京)有限公司.純化試劑盒QIAEX II購自QIAGEN公司(Germany).凝膠電泳所用試劑：Tris、丙烯酰胺、SDS、過硫酸銨、TEMED、甘氨酸購自SIGMA-ALDRICH公司(USA).Quick Start Bradford蛋白測定試劑盒、樣品緩沖液、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)記購自Bio-Rad公司(USA).其余試劑均為國產(chǎn)分析純級.

Afp基因 (GenBank accession no. AY644455) 由中山大學(xué)王珣章教授惠贈，Anp基因 (GenBank accession no. AF295325) 由實驗室所保存.分泌表達(dá)Anp的重組畢赤酵母X-33已構(gòu)建好并于實驗室保存.

1.2 片段置換植酸酶基因的構(gòu)建

根據(jù)分別位于質(zhì)粒pGAPZα A的單克隆位點兩側(cè)的659～679和838～824序列合成一對引物Pf1和Rf1 (表1).根據(jù)文獻(xiàn)[5]選用3對引物(表1)：Pf2和Rf2、Pf3 和Rf3、Pf4和Rf4.配對引物的5'末端彼此反向互補.

表1 引物名稱和序列

片段置換植酸酶基因通過以下步驟構(gòu)建: 分別從2個親本基因中PCR擴增出需要的DNA片段; 將需要的DNA片段通過重疊PCR連接起來 (圖1a～c).為確保連接順序與方向的正確性需要相鄰片段的末端序列高度一致.將植酸酶Anp中第238～337位與第382～444位多肽序列對應(yīng)基因替換為植酸酶Afp的相應(yīng)片段.

所涉及的PCR反應(yīng)均使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶且PCR產(chǎn)物在進(jìn)行下一步實驗前均經(jīng)過QIAEX II 膠純化試劑盒純化.

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化

連接好的基因經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切后插入同樣經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切的pGAPZα A質(zhì)粒中，構(gòu)建成含片段置換序列的重組質(zhì)粒(圖2).每個基因的N端均融合有受GAP啟動子控制的釀酒酵母α分泌信號因子.按照invitrogen的手冊將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33.在轉(zhuǎn)化板上挑取單克隆，并提取酵母基因組DNA.以該DNA為模板及Pf1和Pr1為引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，篩選重組質(zhì)粒插入成功的基因工程酵母菌株.

橫向箭頭表示相關(guān)引物；空白框表示Anp基因序列；灰色框表示Afp基因序列圖1 片段置換植酸酶基因(Frp)構(gòu)建Fig.1 Construction of the segment substitution phytase gene (Frp)

圖2 含片段置換Frp基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Construction of the recombinant plasmid of the segment substitution Frp gene

1.4 片段置換植酸酶的表達(dá)與層析純化

將重組酵母接入500 mLYPD培養(yǎng)基中，30℃、250 rpm振搖48 h后離心，棄上清；使用新鮮YPD加入到沉淀中，30℃、250 rpm繼續(xù)振搖48 h后離心，棄沉淀；用Amicon 8400 cells磁力攪拌超濾器(PM30膜)將上清濃縮至4.5毫升左右.片段置換植酸酶用HiTrapTMSP柱(pH 5.0，A液為10 mmol/L乙酸鈉；B液1 mol/L氯化鈉+10 mmol/L乙酸鈉)進(jìn)行離子交換純化；Anp用HiTrapTMQ柱(pH 5.5，A液10 mmol/L乙酸鈉;B液1 mol/L氯化鈉+10 mmol/L乙酸鈉)進(jìn)行離子交換純化.收集目的蛋白峰后過凝膠過濾柱HiPrepTM26/60 Sephacryl S-200 HR(pH 5.0，150 mmol/L氯化鈉，10 mmol/L乙酸鈉)進(jìn)行分子篩純化.純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)Vivaspin超濾柱濃縮.純化后的蛋白經(jīng)Bradford法測定濃度后保存?zhèn)溆?

1.5 植酸酶活測定

植酸酶活力測定方法基本參照文獻(xiàn)[7].由于原方法中植酸鈉底物(Sigma，P3168)已停產(chǎn)，本研究參考文獻(xiàn)報道[10]，換用底物濃度為5 mmol/L的另一種進(jìn)口植酸鈉(Sigma，P8810).

1.6 胰蛋白酶與脫糖基化酶處理

將20 μg Trypsin溶解于40 μL pH7.5的25 mmol/L碳酸氫鈉溶液中.取含50 μg純化后的Anp和片段置換植酸酶蛋白溶液，并用水補足體積至220 μL；以Anp為例，從220 μL體系中各取100 μL分至a、b管.a管中加入10 μL空白1xBuffer，b管加入10 μL用1xBuffer稀釋的脫糖基化酶PNGase F酶液(含1 000 U的脫糖基化酶活力)；兩管pH經(jīng)精密pH試紙檢測，均為7.5以上.將a、b管置于37℃水浴中過夜.

從a管分別取50 μL溶液至A、C管中，A管加入1 μL空白碳酸氫鈉溶液(pH7.5)，C管加入1 μL Trypsin碳酸氫鈉溶液(0.5 μg/μL，pH7.5).從b管也分別取50 μL體積至B、D管中，B管加入1 μL同樣的空白碳酸氫鈉溶液，D管加入1 μL Trypsin(0.5 μg/ uL，pH7.5).將ABCD置于37℃水浴中2 h.

1.7 蛋白質(zhì)電泳

按照《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)實驗指南》上聚丙烯酰氨凝膠電泳的方法配制4%的濃縮膠和15%的分離膠.電泳完成后將凝膠剝下，浸泡在染色液中進(jìn)行常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色.

1.8 統(tǒng)計分析

全部數(shù)據(jù)用SPSS軟件( release 19.0版，SPSS Science，Chicago，IL )進(jìn)行處理.使用Student非配對t檢驗檢測數(shù)據(jù).P<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 片段置換植酸酶基因構(gòu)建與表達(dá)

重組畢赤酵母基因組的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明片段置換植酸酶基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33細(xì)胞中，且重組畢赤酵母均能分泌有活性的植酸酶.根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行blast比對，片段置換植酸酶與理論序列相似性達(dá)99%.

2.2 片段置換植酸酶純化

片段置換植酸酶Frp和植酸酶Anp經(jīng)過離子交換純化及凝膠過濾柱純化(圖3).

2.3 片段置換提高植酸酶的胰蛋白酶耐受性

與此前報道相同，胰蛋白酶處理后，畢赤酵母分泌表達(dá)的Anp喪失所有植酸酶活力[8]；而新片段置換植酸酶則仍能保留75%的酶活性(圖4).蛋白電泳結(jié)果證明，胰蛋白酶可以將Anp徹底水解，而新片段置換植酸酶則對其有顯著提升的耐受性(圖5第3、7泳道).

2.4 脫糖基化處理削弱胰蛋白酶耐受性

由于酵母糖基化不均勻，導(dǎo)致2種植酸酶(尤其是Anp)分子量均一性差，在聚丙烯酰胺膠上條帶呈彌散狀(圖5第1、5泳道).脫糖基化酶經(jīng)過8 h水浴后，可以將植酸酶上的N-糖基徹底切除.在脫糖基化處理后，2種植酸酶均在50 kD左右形成一條銳帶(圖5第2、6泳道).但脫去糖基后，新片段置換植酸酶Frp的胰蛋白酶耐受性顯著降低.無論是Anp還是新片段置換植酸酶Frp，脫糖基化后均可被胰蛋白酶徹底水解(圖5第4、8泳道).此外，脫糖基化后兩種酶均失去植酸酶活性(圖4).

3 討論

與畢赤酵母表達(dá)的煙曲霉植酸酶不同，煙曲霉本身表達(dá)的植酸酶對蛋白酶耐受性不如黑曲霉本身表達(dá)的植酸酶.而將前者一個暴露環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的敏感酶切位點替換為黑曲霉植酸酶的對應(yīng)位點后，對真菌自身蛋白酶的耐受性顯著上升[11].由于黑曲霉植酸酶上的胰蛋白酶切位點多達(dá)數(shù)十個以上，且分布于整條多肽鏈，很難采用同樣策略去提高其耐受性.本文在前期研究基礎(chǔ)上[9]，通過將黑曲霉植酸酶Anp中第238～337位與第382～444位替換為耐受胰蛋白酶的煙曲霉植酸酶Afp的相應(yīng)片段，顯著改善了Anp對胰蛋白酶的敏感性.證明可通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)改良黑曲霉植酸酶的蛋白酶耐受性.PNGase脫糖基化處理則恢復(fù)了胰蛋白酶對片段置換后的Anp的攻擊性.由于該脫糖基化酶特異性水解多肽鏈上N-糖基化，因此上述結(jié)果表明Afp對應(yīng)片段上的N-糖基化可顯著影響畢赤酵母表達(dá)Anp的胰蛋白酶耐受性.

a. Frp離子交換純化A280 nm圖譜；b. Frp凝膠純化A280 nm圖譜；c. Anp植酸酶離子交換純化A280 nm圖譜；d. Anp植酸酶凝膠純化A280 nm圖譜；x軸表示體積(mL)；左側(cè)表示吸光度(mAU)；右側(cè)表示電導(dǎo)率(mS/cm)圖3 Frp和Anp 280 nm吸收光譜圖(實線)和電導(dǎo)率圖(虛線)Fig.3 The A280 spectrum (solid line) and conductivity figure (dotted line) of Frp and Anp

T為胰蛋白酶；P為脫糖基化酶；-為未添加酶；+為添加酶；星號表示與Anp差異顯著圖4 Anp 和Frp經(jīng)不同處理后的相對比活力Fig.4 The relative specific activity of Anp and Frp by different treatment

M. 分子質(zhì)量標(biāo)記；1.Anp T-P-；2.Anp T-P+；3.Anp T+P-；4.Anp T+P+；5.FrpT-P-；6.Frp T-P+； 7.Frp T+P-；8.Frp T+P+；T為胰蛋白酶；P為脫糖基化酶；-為未添加酶；+為添加酶圖5 Anp和Frp在胰蛋白酶與脫糖基化酶消化后的非變性聚丙烯酰胺凝膠Fig.5 Non-denaturing polyacrylamide gel of Anp and Frp after trypsin and deglycosylation enzymes digestion

2種植酸酶的天然構(gòu)型在實驗過程中除酶處理效應(yīng)外均未受破壞，從而能被觀察到較真實的胰蛋白酶耐受性.無論是在脫糖基化、胰蛋白酶切或聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗中，本研究均未使用任何去垢劑(如可促進(jìn)PNGase脫糖基化處理的NP-40等)、離液劑(尿素)與烷基化試劑等可能破壞蛋白構(gòu)型的化學(xué)試劑.實驗結(jié)果也表明脫糖基化與胰蛋白酶水解均能徹底完成，而除脫糖基化酶與胰蛋白酶外的其他溶液物質(zhì)對植酸酶活無影響(圖4、圖5).但無論是Anp或片段置換植酸酶，均隨著N-糖基化的去除而失去植酸酶活性.而當(dāng)未對片段置換植酸酶添加足夠PNGase，除導(dǎo)致脫糖基化不徹底外，也能保留部分酶活.這說明N-糖基化除與蛋白酶耐受性密切相關(guān)外，也在植酸酶水解植酸的過程中發(fā)揮重要作用.

本研究結(jié)果表明可能通過在Anp上添加Afp內(nèi)第23～337位與第382～444位片段上的潛在N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)，提升胰蛋白酶耐受性.N-糖基化修飾模式受多種因素影響.有報道在德國BASF商品黑曲霉植酸酶10個潛在的N-糖基化位點中，實際有2個位點完全未被糖基化，2個部分糖基化[11].Anp的一級序列與空間結(jié)構(gòu)對糖基化效率及最終傳導(dǎo)至對蛋白酶耐受性的影響，還需通過進(jìn)一步研究來揭示.

致謝 感謝中山大學(xué)王珣章教授贈與基因以及蔣宗勇研究員、劉文華博士對項目的支持和指導(dǎo).

[1] WODZINSKI R J，ULLAH A H. Phytase[J]. Adv Appl Microbiol，1996，42：263-302.

[2] 丁忠留，嚴(yán)建剛. 植酸酶應(yīng)用與節(jié)磷減排[J]. 國外畜牧學(xué)(豬與禽)，2011，1：87-88．

[3] RODRIGUEZ E，PRRESO J M，HAN Y，et al. Different sensitivity of recombinantAspergillusnigerphytase (r-PhyA) and Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase (r-AppA) to trypsin and pepsin in vitro [J]. Arch Biochem Biophys，1999，365(2): 262-267．

[4] 何 前，貝錦龍，容 庭，等. 市售商品植酸酶的作用效果評定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(7): 170-172，195．

[5] BEI J，CHEN Z，F(xiàn)U J，et al. Structure-based fragment shuffling of two fungal phytases for combination of desirable properties[J]. J Biotechnol，2009，139(2): 186-193．

[6] ULLAH A H，MULLANEY E J. Aspergillus ficuum phytase: partial primary structure，substrate selectivity，and kinetic characterization[J]. Prep Biochem，1988，18(4): 459-471．

[7] 貝錦龍，王瑾雯，王珣章，等. 人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在畢赤酵母系統(tǒng)中的高效表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報，2001(3): 254-258．

[8] 陳 莊，付 捷，貝錦龍，等. 兩種重組真菌植酸酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)比較[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007(5): 1141-1146．

[9] 陳 莊，貝錦龍，廖 玲，等. 真菌嵌合體植酸酶的構(gòu)建及其抗蛋白酶水解特性研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008(4): 72-76，87．

[10] 閔兆升，郭會明，洪厚勝. 飼用植酸酶酶活測定過程中底物的影響研究[J]. 中國飼料，2014(19): 30-32．

[11] WYSS M，PASAMONTES L，F(xiàn)RIEDLEIN A，et al. Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size，glycosylation pattern，and engineering of proteolytic resistance[J]. Appl Environ Microbiol，1999，65(2): 359-366．

Glycosylation of fungal phytase affects its resistance to trypsin

ZHU Qingfeng1，WANG Zhilin2，CUI Baiyuan1，ZHANG Qi1，CHEN Zhuang1，YAN Shijuan1，BEI Jinlong1

(1.Agro-biological Gene Research Center，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640;2.Institute of Animal Science，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640)

Using overlapping PCR technique，the DNA sequences encoding protein regions 238～337 and 382～444 fromAspergillusnigerNRRL 3135 phytase gene were replaced by correspondingAspergillusfumigatusATCC 13073 phytase sequences. The constructed Fragments-replaced phytase gene was inserted in pGAPZα A plasmid，and transformed into Pichia pastoris. Secreted Fragments-replaced phytase with phytase activity was purified through ion-exchange combined with gel filtration chromatography. While compared withAspergillusnigerNRRL 3135 phytase，F(xiàn)ragments-replaced phytase showed significantly improved resistance to tryptic digestion. However，after the N-glycosylation removed by PNGase thoroughly，the sensitivity of Fragments-replaced phytase to trypsin was recovered. These results indicated that the N-glycosylation modification of the replacing regions inAspergillusfumigatusATCC 13073 phytase enhanced the trypsin resistance ofAspergillusnigerNRRL 3135 phytase expressed in Pichia pastoris．

phytase;Aspergillusniger;Aspergillusfumigatus; glycosylation; proteolysis

2016-06-28.

廣東省農(nóng)業(yè)攻關(guān)引導(dǎo)項目(2012B020305011)； 廣東省科技計劃項目(2016B070701013)； 廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目(2014A030310489)．

1000-1190(2016)05-0746-06

Q816

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: jinlongbei@agrogene.ac.cn．