陳 潔， 陳思禮， 吳匯蘭

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

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魚(yú)腥藻PCC7120染色體基因?qū)sr0757/alr0758的表達(dá)優(yōu)化及其鑒定

陳 潔， 陳思禮*， 吳匯蘭

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

NCBI預(yù)測(cè)魚(yú)腥藻PCC7120染色體上的基因?qū)sr0757/alr0758可能構(gòu)成一個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng).為研究其是否屬于毒素-抗毒素系統(tǒng)家族，分別構(gòu)建這兩個(gè)基因的表達(dá)載體.用1.0 mM IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行純化與western blot檢測(cè).SDS-PAGE結(jié)果顯示：asr0757與alr0758在37℃下誘導(dǎo)6 h后，均成功誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白asr0757(13.5 KD)和alr0758(17.9 KD).抗毒素表達(dá)量較好，毒素alr0758表達(dá)量較少.通過(guò)設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間梯度和IPTG濃度梯度優(yōu)化毒素基因表達(dá)條件，優(yōu)化結(jié)果顯示：毒素基因alr0758在28℃，IPTG濃度為0.4 mM，誘導(dǎo)10 h時(shí)有最大表達(dá)量.蛋白純化與western blot結(jié)果證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為目的蛋白．

魚(yú)腥藻PCC7120；asr0757/alr0758； 表達(dá)； 優(yōu)化； 鑒定

藍(lán)藻是一種存在于不同的環(huán)境中的古老而又多變的原核生物[1]，這種能存在于不同環(huán)境中的特性反映了其對(duì)多變與極端環(huán)境的強(qiáng)大適應(yīng)能力[2].魚(yú)腥藻PCC7120作為藍(lán)藻中的模式生物，其基因組測(cè)序工作于2001年由日本Kazusa研究所最早完成[3].當(dāng)前，對(duì)于藍(lán)藻的分子生物學(xué)研究主要集中在基因克隆，表達(dá)及功能鑒定與表達(dá)調(diào)控分析等方面[4]．

有研究表明魚(yú)腥藻染色體上存在大量毒素-抗毒素系統(tǒng)(TAS，toxin-antitoxin system)[5]，TAS的存在有利于魚(yú)腥藻更好地適應(yīng)環(huán)境脅迫.TAS由位于同一個(gè)操縱子下的具有多個(gè)堿基重疊的兩個(gè)基因組成，一個(gè)編碼穩(wěn)定的毒素蛋白，另一個(gè)編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白[6].當(dāng)前對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能的看法各異，Engelberg-Kulka等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明TAS在外界壓力條件下介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，Gerdes等[8]通過(guò)對(duì)TAS系統(tǒng)在環(huán)境脅迫下抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的研究，提出了“生長(zhǎng)調(diào)節(jié)模型”．

目前絕大多數(shù)細(xì)菌染色體上預(yù)測(cè)出的TAS基因?qū)ι形唇?jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，asr0757/alr0758是其中之一.本實(shí)驗(yàn)是首次對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)蛋白純化與western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物.具體而言，首先通過(guò)分子生物學(xué)方法成功地分別構(gòu)建基因?qū)sr0757與alr0758的表達(dá)載體，其后使用IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)出帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白，最后優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，并對(duì)蛋白進(jìn)行純化以及western blot鑒定.本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，為魚(yú)腥藻染色體上潛在TAS基因的研究提供參考，創(chuàng)造較好的研究條件，同時(shí)對(duì)于完善 TAS系統(tǒng)理論，補(bǔ)充發(fā)展其分子機(jī)制具有一定的意義．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用藻種，魚(yú)腥藻PCC7120(Anabaenasp. PCC7120)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB).宿主菌E.coilDH5α 和E.coilBL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)是保存的菌種.克隆載體pMD18-T購(gòu)自Takara公司.表達(dá)載體pET30a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存.PCR引物合成及測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé).一抗TubaiB Rabbit ployAb(兔源抗His-Tag抗體)；二抗，Goat anti-Rabbit IgG(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)購(gòu)自proteintech公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2 .1PCC7120 基因組 DNA 提取 本實(shí)驗(yàn)藍(lán)藻PCC7120基因組的提取方法請(qǐng)參照文獻(xiàn)[9]．

1.2 .2克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構(gòu)建 基因的克隆按照分子生物學(xué)操作標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[10]，設(shè)計(jì)引物并在引物中添加酶切位點(diǎn)，以魚(yú)腥藻PCC7120的DNA為模板，運(yùn)用Touch-Down PCR擴(kuò)增得到asr0757目的基因片段和alr0758目的基因片段，PCR引物見(jiàn)表1.PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，退火溫度由74℃開(kāi)始每循環(huán)降低0.5℃，退火反應(yīng)40 s后于72℃延伸40 s，15個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，退火溫度由74℃開(kāi)始每循環(huán)降低1.0℃，退火反應(yīng)40 s后于72℃延伸40 s，20 個(gè)循環(huán)；72℃保持7 min.PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T連接并導(dǎo)入E.coilDH5α中，涂平板藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)菌落PCR以及雙酶切鑒定后送測(cè)序.測(cè)序正確后保存質(zhì)粒，分別命名為 pMD18-T-asr0757和pMD18-T-alr0758．

表1 PCR引物及序列

注：下劃線為括號(hào)內(nèi)對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)序列．

1.2 .3重組表達(dá)載體 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的構(gòu)建BamH1和EcoR1雙酶切測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD18-T-asr0757、pMD18-T-alr0758以及表達(dá)載體pET-30a(+)，回收各自雙酶切目的片段，回收的基因片段asr0757與alr0758分別與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化E.coilBL21(DE3)，涂于含有50 μg/mL 硫酸卡納霉素的LB 平板篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序檢測(cè)正確后分別命名為pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758．

1.2 .4目的基因asr0757，alr0758的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒 pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758的BL21菌種分別接種于含50 μg/mL 硫酸卡納霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床培養(yǎng)約3 h至 OD600=0.4～0.6后加入1 mM 的IPTG，于220 rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)6 h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)．

1.2 .5毒素基因alr0758誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1)最佳誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn).含重組質(zhì)粒pET-30a-alr0758的BL21菌37℃培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6 時(shí)，加入 IPTG，使其終濃度為1.0 mmol/L，于28℃誘導(dǎo)表達(dá)，在24 h內(nèi)每2 h收集一次菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)．2)最佳 IPTG 濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn).含重組質(zhì)粒pET-30a-alr0758的BL21菌37℃培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6時(shí)，加入IPTG 的終濃度梯度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mM，在28℃下誘導(dǎo)最佳時(shí)長(zhǎng)收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況．

1.2 .6目的蛋白純化與western blot檢測(cè) 誘導(dǎo)基因asr0757與alr0758表達(dá)，收集菌體進(jìn)行超聲波破碎處理，上清過(guò)Ni-NTA柱，洗脫后得到目標(biāo)蛋白，將得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待膠上蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上用WB封閉液封閉，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min，加入1∶5000稀釋的兔抗6×His的多抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜.次日取出繼續(xù)搖動(dòng)1～2 h.加入Western洗滌液，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10 min.吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌7～10 min.共洗滌3～4次. TBS洗滌后，加入1∶10000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆體，室溫反應(yīng)1.5 h，充分洗滌，加入新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，待顯色條帶清晰后立即用蒸餾水洗滌硝酸纖維素膜，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組：BL21菌和含pET30a空載體的BL21轉(zhuǎn)化菌．

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)腥藻PCC7120總DNA的提取

本實(shí)驗(yàn)基因組DNA的提取主要是SDS裂解法，并對(duì)傳統(tǒng)的酚-氯仿法作了改進(jìn)，總共提取7管總DNA，為后續(xù)的PCR，以及菌落PCR檢測(cè)提供需要，總DNA提取后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示所有的條帶在預(yù)計(jì)目的條帶處均出現(xiàn)較亮的單一條帶，如圖1所示，表明魚(yú)腥藻PCC7120總DNA提取成功．

M:DL5000標(biāo)準(zhǔn)marker；1～7：魚(yú)腥藻PCC7120總DNA．圖1 魚(yú)腥藻PCC7120 DNA提取Fig.1 DNA extraction of Anabaena sp. PCC7120

2.2 克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構(gòu)建

Touch-down PCR擴(kuò)增的基因alr0758與asr0757的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期大小相符：asr0757大小為210 bp和alr0758為342 bp(圖2) .藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆雙酶切檢測(cè)(圖3)結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)大小處有單一的目的條帶，雙酶切檢測(cè)中有2條帶，分別為目的條帶與空T載體條帶(2 692 bp).檢測(cè)正確的克隆菌送往金斯瑞測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 所公布的asr0757 和alr0758 序列Blast 比對(duì)，結(jié)果顯示堿基完全匹配，表明克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構(gòu)建成功．

M:DL5000標(biāo)準(zhǔn)marker；1～2:asr0757 PCR 產(chǎn)物；3～4:alr0758 PCR 產(chǎn)物．圖2 PCR電泳檢測(cè)圖Fig.2 Examination of PCR products by agar electrophoresis

M:DL5000標(biāo)準(zhǔn)marker；1～2：克隆質(zhì)粒pMD18-T-asr0757雙酶切產(chǎn)物；3～4：克隆質(zhì)粒pMD18-T-alr0758雙酶切產(chǎn)物．圖3 pMD18-T-asr0757 和pMD18-T-alr0758雙酶切電泳檢測(cè)Fig.3 Examination of pMD18-T-asr0757 and pMD18-T-alr0758 with the double enzyme digestion

2.3 重組表達(dá)載體 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的構(gòu)建

選用雙酶切位點(diǎn)BamH1和EcoR1，對(duì)重組克隆載體pMD18-T-asr0757 和pMD18-T-alr0758 進(jìn)行雙酶切回收，連接經(jīng)相同酶雙酶切后的pET-30a轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)(見(jiàn)圖4)以及雙酶切檢測(cè)(見(jiàn)圖5)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)大小處出現(xiàn)目標(biāo)條帶(asr0757 為210 bp，alr0758為342 bp).雙酶切檢測(cè)圖顯示兩條條帶，一條為目的帶另一條為pET-30a空載條帶(5 422 bp)，送金斯瑞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示目的片段完全正確插入，重組表達(dá)載體 pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758構(gòu)建成功．

M:DL5000標(biāo)準(zhǔn)marker；1～2：表達(dá)重組菌pET-30a-asr0757菌落PCR產(chǎn)物；3～5：表達(dá)重組菌pET-30a-alr0758菌落PCR產(chǎn)物．圖4 表達(dá)載體pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758菌落PCR檢測(cè)Fig.4 Colony PCR detection of the expression vector pET-30a-asr0757 and pET-30a-alr0758

M:DL5000標(biāo)準(zhǔn)marker；1：重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-asr0757雙酶切產(chǎn)物；2：重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-alr0758雙酶切產(chǎn)物圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758雙酶切檢測(cè)Fig.5 Detection of expression vectors pET-30a-asr0757 and pET-30a-alr0758 with double enzyme digestion

2.4 目的基因asr0757，alr0758的誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)菌pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758分別在37℃與28℃下，加入1.0 mM IPTG，220 rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)表達(dá)6 h后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè).電泳結(jié)果顯示，pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758分別在約13.5 kD(圖6)和17.9 kD(圖7)處有表達(dá)條帶，抗毒素表達(dá)量較好，毒素表達(dá)量則較少.抗毒素基因asr0757與毒素基因alr0758表達(dá)的蛋白預(yù)測(cè)大小分別為8.068 kD，12.533 kD，加上空載體pET-30a自身帶有的組氨酸標(biāo)簽與酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生的融合蛋白大小分別為asr0757(13.5 kD)和alr0758(17.9 kD)，SDS-PAGE膠上顯示的誘導(dǎo)條帶的大小與預(yù)測(cè)的目的基因誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白的大小相符合．

M：預(yù)染蛋白marker；1:pET-30a菌未誘導(dǎo)；2:pET-30a菌誘導(dǎo)表達(dá)； 3： 重組菌pET-30a-asr0757未誘導(dǎo)；4：重組菌pET-30a-asr0757誘導(dǎo)表達(dá)．圖6 重組菌pET-30a-asr0757誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)Fig.6 Examination of recombinant protein pET-30a-asr0757 by SDS-PAGE

M：預(yù)染蛋白marker；1:pET-30a菌未誘導(dǎo)；2:pET-30a菌誘導(dǎo)表達(dá)；3：重組菌pET-30a-alr0758未誘導(dǎo)；4：重組菌pET-30a-alr0758誘導(dǎo)表達(dá)圖7 重組菌pET-30a-alr0758誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)Fig.7 Examination of recombinant protein pET-30a-alr0758 by SDS-PAGE

2.5 毒素基因alr0758誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

由圖7可知，毒素基因表達(dá)量較少，為后續(xù)蛋白純化的需求，對(duì)毒素基因alr0758表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，主要從誘導(dǎo)時(shí)間梯度以及IPTG誘導(dǎo)濃度梯度這兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化．

2.5 .1最佳誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 圖8為不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響. 重組菌pET-30a-alr0758在誘導(dǎo)2 h時(shí)即有較明顯的表達(dá)，在10 h時(shí)有最大表達(dá)量，之后延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量基本保持不變或呈減弱趨勢(shì)，故重組蛋白pET-30a-alr0758的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h．

M：預(yù)染蛋白marker；1：空載體pET-30a誘導(dǎo)表達(dá)；2～14：誘導(dǎo)時(shí)間依次為0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h的pET-30a-alr0758重組菌圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白pET-30a-alr0758表達(dá)量的影響Fig.8 Influence of induction time on protein expression of pET-30a-alr0758

2.5.2最佳 IPTG 濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn) IPTG終濃度梯度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖9所示，pET-30a-alr0758重組菌于28℃培養(yǎng)10 h，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.4 mM時(shí)有最大的誘導(dǎo)表達(dá)量，故pET-30a-alr0758的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.4 mM．

M：預(yù)染蛋白marker；1：空載體pET-30a誘導(dǎo)表達(dá)；2～8:IPTG 誘導(dǎo)濃度依次為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mM的pET-30a-alr0758重組菌．圖9 不同IPTG 誘導(dǎo)濃度對(duì)重組蛋白pET-30a-alr0758表達(dá)量的影響Fig.9 Influence of IPTG concentration on protein expression of pET-30a-alr0758

2.6 目的蛋白純化與western blot檢測(cè)

重組表達(dá)菌在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)Ni-NTA柱后收集洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)(設(shè)置對(duì)照組)，結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)大小處出現(xiàn)單一的目標(biāo)條帶，如圖10(A)所示，asr0757(13.5 kD)和alr0758(17.9 kD)，大小與理論值相符，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組BL21和含pET-30a空載體的BL21轉(zhuǎn)化菌則沒(méi)有出現(xiàn)目標(biāo)條帶，表明純化效果較好.western blot結(jié)果如圖10(B)所示，重組菌pET30a-asr0757 與pET-30a-alr0758誘導(dǎo)純化的蛋白分別在約13.5 kD和17.9 kD處出現(xiàn)明顯的特異性條帶而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組同樣在相同的位置沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明純化所得蛋白為目的蛋白．

A) M：預(yù)染蛋白marker；1:pET-30a-asr0757重組菌；2:pET-30a-alr0758重組菌；3：含空載pET-30a的BL21菌；4:BL21菌；B) 1:pET-30a-asr0757重組菌；2:pET-30a-alr0758重組菌；3：含空載pET-30a的BL21菌；4:BL21菌．圖10 重組蛋白純化(A)與western blot鑒定(B)Fig.10 Purification of the recombinant proteins(A) and identification by western blot(B)

3 討論

盡管毒素-抗毒素系統(tǒng)廣泛地存在于細(xì)菌中，且不同來(lái)源的毒素-抗毒素基因的同源性各不相同或者相差很大，但已有的生物學(xué)分析顯示其遺傳結(jié)構(gòu)以及功能非常的相似[11].TAS根據(jù)毒素性質(zhì)的不同，可以分為3種類(lèi)型：Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型.Ⅱ型TAS分布最為廣泛，研究較多，比較常見(jiàn)的Ⅱ型 TAS有MazF和RelE，本文研究的基因隸屬M(fèi)azEF家族，大腸桿菌染色體上的MazEF是研究最為清楚的II型TAS之一，其中的毒素蛋白MazF是具有序列特異性的核酸內(nèi)切酶[12]，當(dāng)細(xì)胞遭遇外界環(huán)境脅迫時(shí)，不穩(wěn)定的的抗毒素蛋白MazE被降解，穩(wěn)定的毒素蛋白游離出來(lái)作用于細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡[13]．

本文研究的基因?qū)sr0757/alr0758通過(guò)前期NCBI Blast比對(duì)得知其與大腸桿菌中的TAS系統(tǒng)MazEF具有較高的同源性，且遺傳結(jié)構(gòu)相同，asr0757和alr0758具有14個(gè)堿基的重疊區(qū)域，通過(guò)這對(duì)基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的研究以及在染色體上遺傳結(jié)構(gòu)特征，初步判定基因asr0757/alr0758也具有TAS基因功能構(gòu)成TA系統(tǒng)．

成功構(gòu)建的表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示，基因?qū)sr0757與alr0758均成功表達(dá)，但是毒素基因alr0758表達(dá)量較小，含有毒素基因alr0758的重組菌pET-30a-alr0758在37℃下，220 rpm時(shí)生長(zhǎng)非常緩慢且誘導(dǎo)后幾乎沒(méi)有目的蛋白的產(chǎn)生，但是在28℃，160 rpm誘導(dǎo)條件下目的蛋白表達(dá)量明顯增多，與含抗毒素基因的重組菌pET-30a-asr0757相比較，無(wú)論是活化階段還是誘導(dǎo)階段，pET-30a-alr0758明顯比pET-30a-asr0757長(zhǎng)勢(shì)緩慢，這也在一定程度上顯示了毒素基因alr0758的毒性作用，同時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組菌株比未加入IPTG的對(duì)照組長(zhǎng)勢(shì)慢，說(shuō)明IPTG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也具有一定的毒性作用，pET-30a-alr0758在28℃，160 rpm，蛋白表達(dá)量較為可觀，表明低溫低速時(shí)誘導(dǎo)可以增加可溶性蛋白量[14]，但是溫度若過(guò)低時(shí)藻類(lèi)生長(zhǎng)速度緩慢，蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)困難或不表達(dá).由于藍(lán)藻體內(nèi)存在的大量TAS使其應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)更加有利，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是對(duì)TAS家族基因的一個(gè)補(bǔ)充，具有一定的理論以及實(shí)際意義，期望能夠?yàn)楹罄m(xù)染色體上其它可能的TAS基因的探究提供一定的實(shí)驗(yàn)參考．

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Optimized expression of chromosomal genepairasr0757/alr0758 inAnabaenasp. PCC 7120 and its identification

CHEN Jie， CHEN Sili， WU Huilan

(College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074)

Chromosomal gene pairasr0757/alr0758 inAnabaenasp. PCC 7120 was predicted to belong to the toxin-antitoxin system (TAS) with homology analysis by software NCBI. To verify this， expression vectors were constructed for the above two genes， respectively. The vectors were induced by 1.0 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG).Then， the inducing conditions were optimized， after which the proteins were purified and identified through western blot. Result of SDS-PAGE revealed that proteins of genesasr0757/alr0758 were expressed successfully after induced for 6 h at 37℃. The expression level ofasr0757(13.5 kD) appeared to be higher than that ofalr0758(17.9 kD). Therefore， induction time gradient and IPTG concentration were optimized to improve the expression level ofalr0758. Results showed that genealr0758 obtained relatively large expression quantity after 10 h induction at 37℃ with 0.4 mM IPTG. Protein purification and western blot results showed that the expression proteins were the target proteins.

Anabaenasp.PCC7120;asr0757/alr0758; expression; optimization; identification

2015-11-04.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31001099/C190101)；中央高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(CJSl3003，CJS13004)；中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(XJS09002)；“十二五”國(guó)家級(jí)中南民族大學(xué)民族藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心建設(shè)項(xiàng)目.

1000-1190(2016)02-0263-06

Q812

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: sili.chen@163.com．