陳水昌，李　穎，盧國森

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，廣東肇慶506020； 2.佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東佛山528244）

補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GADD34、ERO1、IRE-1干預(yù)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

陳水昌1，李穎1，盧國森2

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，廣東肇慶506020； 2.佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東佛山528244）

●“實(shí)驗(yàn)”雖然是現(xiàn)代科學(xué)研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學(xué)者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實(shí)驗(yàn)也”，顏之推說“昔在江南，不信有千人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實(shí)驗(yàn)也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學(xué)意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)并非只是經(jīng)驗(yàn)之學(xué)，而更充滿實(shí)驗(yàn)的思想和方法。實(shí)驗(yàn)中醫(yī)藥學(xué)，將現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)科學(xué)的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法融合起來，開拓現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的新領(lǐng)域。

目的：探討補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞凋亡過程中非折疊蛋白反應(yīng)的作用機(jī)制。方法：將新西蘭大白兔9只隨機(jī)分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。中藥組、西藥組分別用中藥復(fù)方提取液、雌二醇混懸液灌胃，空白組以同等量的蒸餾水灌胃，1個(gè)月后制備含藥血漿。選用1 d齡SD大鼠獲取原代的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，中藥組、西藥組分別給予對(duì)應(yīng)的含藥血漿培養(yǎng)，正?？瞻捉M以及凋亡空白組給予空白組血漿培養(yǎng)。24 h后分別檢測GADD34、ERO1、IRE-1等凋亡蛋白的光密度值（OD）。結(jié)果：與凋亡空白組相比，中藥組、西藥組GADD34、ERO1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方有可能通過非折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，并能在一定程度上抑制細(xì)胞的凋亡。

骨質(zhì)疏松癥；中藥復(fù)方；GADD34；ERO1；IRE-1

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是老年常見病、多發(fā)病，患者診出率、就診率低，但骨折的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)高，在全世界范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率［1-2］。對(duì)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前研究大多集中于細(xì)胞水平，對(duì)亞細(xì)胞水平的作用靶點(diǎn)研究較少［3-5］。盡管中醫(yī)中藥在防治骨質(zhì)疏松癥方面的研究較多，但其作用機(jī)理目前尚未清楚，局限了中醫(yī)藥在世界的推廣和應(yīng)用。本項(xiàng)目通過補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用，探討補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞凋亡過程中非折疊蛋白反應(yīng)的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、丹參、黃芪等10味中藥組成，該方所含生藥量為1.43 kg/L，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供。戊酸雌二醇片，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司提供（國藥準(zhǔn)字J20080036，批號(hào)：177A12）。培養(yǎng)細(xì)胞用1 d齡SPF級(jí)健康雌性SD大鼠20只，制備藥物血漿用新西蘭大白兔9只，體質(zhì)量（2～2.2）kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含藥血漿的制備［6-7］新西蘭大白兔9只，隨機(jī)分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。中藥組的濃度為1.096 g/kg，西藥組的濃度為0.038 mg/kg，空白組以同等量蒸餾水灌胃，灌胃給藥容積為10 mL/kg。大白兔連續(xù)灌胃1 w，最后1次灌胃后2 h行心臟采血，將獲得的全血置于含抗凝劑的試管中，5～10 min后3 000 r/min離心15 min，吸取上清，滅活，抽濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2成骨細(xì)胞的培養(yǎng)［8-9］1 d齡SD大鼠，75%酒精浸泡15 min，取出頭蓋骨，剔凈附著軟組織，0.25%胰蛋白酶預(yù)消化，0.1%Ⅱ型膠原酶消化。離心，獲取細(xì)胞，PBS液沖洗，置含10%NCS-MEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2中靜置培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次。棄去原培養(yǎng)液，加入含10%的胎牛血漿MEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)4～7 d，單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。傳代時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用D-Hank′s液沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，棄去消化液，加入培養(yǎng)液，吹打培養(yǎng)瓶底，使細(xì)胞脫落，制成細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2中靜置培養(yǎng)。

1.2.3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10-11］采用紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，紫外線照射成骨細(xì)胞10 min，照射過程中以0.5 mL D-Hanks液濕潤皿底。照射后中藥組和西藥組分別給予對(duì)應(yīng)的含藥血漿培養(yǎng)，凋亡空白組和正?？瞻捉M均給予常規(guī)血漿培養(yǎng)。24 h后，收集成骨細(xì)胞做下一步實(shí)驗(yàn)。正?？瞻捉M不用紫外線照射。

1.2.4線粒體提取及蛋白質(zhì)測定［12-13］采用細(xì)胞勻漿法對(duì)細(xì)胞分離線粒體。使細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面，分別加入PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面。然后抽去，再加入胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面，置入37℃培養(yǎng)箱，經(jīng)離心、渦旋震蕩，移出上清液后，保留沉淀顆粒以獲得線粒體沉淀物。再重復(fù)上述步驟，以獲得高純線粒體樣品，最后置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。將線粒體沉淀，加入適量裂解液，室溫放置5 min，其間不斷渦旋攪動(dòng)，12 000 rpm離心棄去不溶物，吸取上清液，即為蛋白質(zhì)樣品溶液。采用檢測蛋白質(zhì)光密度（OD值）的方法分別檢測GADD34、ERO1、IRE-1等凋亡蛋白含量。

2　結(jié)果

2.1成骨細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期變化

與正?？瞻捉M相比，中藥組、西藥組、凋亡空白組G0/G1期、G2M期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞明顯減少，凋亡百分率顯著增高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1　紫外線對(duì)成骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響?。ā纒）

表1　紫外線對(duì)成骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響　（±s）

注：與正?？瞻捉M比較，1）P＜0.05

組別　G0/G1　S　G2/M　凋亡率（%）正常空白組 39.335±1.789　53.987±2.970　6.673±1.383　3.728±0.830凋亡空白組 44.181±1.9591）46.835±1.3961）　8.986±1.7751）10.150±0.8381）西藥組　45.792±2.2511）41.069±2.7311）13.140±1.4271）　7.745±0.9621）中藥組　45.596±2.3281）43.528±2.9811）10.880±1.2701）　8.284±0.5411）

2.2蛋白表達(dá)的變化

蛋白質(zhì)光密度值（OD值）檢測顯示，正常空白組有少量凋亡蛋白表達(dá)，凋亡空白組蛋白表達(dá)水平最高。與凋亡空白組相比，中藥組、西藥組GADD34、ERO1降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IRE-1亦降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組中蛋白表達(dá)的OD值?。ā纒）

表2　各組中蛋白表達(dá)的OD值?。ā纒）

注：與凋亡空白組比較，1）P＜0.05；與中藥組比較，2）P＜0.05

組別　GADD34　ERO1　IRE-1正?？瞻捉M　0.623±0.074　0.640±0.102　0.665±0.056凋亡空白組　1.428±0.150　1.351±0.191　1.341±0.131中藥組　1.132±0.2391）　1.216±0.2341）　1.234±0.126西藥組　1.238±0.0971）　0.983±0.1101）2）　1.278±0.097

3　討論

目前研究表明，非折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有以下3條主要的途徑：CHOP/GADD153途徑、Caspases-12途徑及ASK1/JNK途徑［14-15］。GADD34作為一種細(xì)胞周期蛋白，在特定情況下，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、DNA損害和細(xì)胞周期停滯時(shí)表達(dá)上調(diào)，一些在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭械难芯刻崾綠ADD34蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)。所以GADD34是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）后蛋白質(zhì)合成功能恢復(fù)的關(guān)鍵性分子。

ERO1主要參與維持ERS內(nèi)氧化狀態(tài)。ERO1參與氧化二硫鍵異構(gòu)酶，維持蛋白折疊過程持續(xù)進(jìn)行。ERO1在形成二硫鍵的過程中可產(chǎn)生H2O2，因此ERO1激活是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）產(chǎn)生的重要來源之一。過多的ROS產(chǎn)生，超過細(xì)胞抗氧化防御能力就會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起氧化應(yīng)激和ERS等過程。

IRE-1介導(dǎo)的XBP1剪接誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)能促進(jìn)細(xì)胞的生存，IRE-1的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)人胚腎細(xì)胞HEK193的凋亡。激活的IRE-1，其胞漿的酶結(jié)構(gòu)域連接接頭分子TRAF2，與ASK1共同形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物，從而激活JNK?；罨蟮腏NK可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，通過磷酸化激活c-jun、c-Fos、EIK-1等轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá)［16］。

在本實(shí)驗(yàn)中，凋亡空白組中GADD34、ERO1、 IRE-1表達(dá)較正?？瞻捉M明顯升高，說明在紫外線誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡過程中，GADD34、ERO1、IRE-1參與的CHOP/GADD153途徑、ASK/JNK途徑激活，從而促使細(xì)胞凋亡發(fā)生［17-18］。

在中醫(yī)學(xué)中，骨質(zhì)疏松癥屬“骨痿”范疇，根據(jù)腎主骨的理論，其病因病機(jī)當(dāng)首責(zé)各種原因?qū)е履I（氣、陰、陽）的不足，影響骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充養(yǎng)，易發(fā)生骨骼脆弱無力，即骨質(zhì)疏松性骨折。補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血化瘀之功效，方中以補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽壯骨為君藥，肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強(qiáng)補(bǔ)腎陽之功為臣藥，佐以黃芪補(bǔ)中益氣，丹參、當(dāng)歸活血化瘀，熟地、白芍滋陰益精。通過對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果的分析，中藥組和西藥組均可以降低GADD34、ERO1蛋白的表達(dá)水平，與凋亡空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，我們可以認(rèn)為，在降低或者阻斷細(xì)胞凋亡途徑方面，中藥復(fù)方在一定的程度上可以達(dá)到與雌二醇相同的效果，這對(duì)于闡釋和推廣中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松癥具有重要的意義。

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（編輯：張世霞）

Mechanism of Bushen Jianpi compound on osteoblasts apoptosis by regulating endoplasmic reticulum proteins GADD34，ERO1 and IRE-1

Chen Shuichang1，Li Ying1，Lu Guosen2
（1.Department of Orthopaedics，Guangdong Province Integrative Medicine Hospital，Zhaoqing Guangdong 506020；2.Third people′s Hospital of Nanhai，F(xiàn)oshan Guangdong，528244）

Objective：To explore the mechanism of Bushen Jianpi compound on inhibition of osteoblasts apoptosis by regulating unfolded protein.Methods：9 New Zealand rabbits were randomly divided into the Chinese medicine group（Bushen Jianpi compound group），the western medicine group（estradiol group）and blank group.A month after administration，serum containing medicine was prepared in each groups.1day old SD rats were used to culture primary generation osteoblasts. Osteoblasts were divided into the Chinese medicine group，the western medicine group，apoptosis blank group and blank group.24 h after culture，expressions of GADD34、ERO1 and IRE-1 were examined.Results：Compared with the apoptosis blank group，the expression levels of GADD34 and ERO1 in serum of the Chinese medicine group and the western medicine group were decreased obviously（P<0.05）.Compared with the Chinese medicine group，expression level of ERO1 was decreased obviously in western medicine group（P<0.05）.Conclusion：Bushen Jianpi compound maybe regulate and control osteoblasts through apoptosis pathway mediated by unfolded protein，and inhibit osteoblasts apoptosis by regulating expressions of GADD34、ERO1、IRE-1 to some extent.

osteoporosis；Chinese herbal compound；GADD34；ERO1；IRE-1

R285

A

1671-0258（2016）05-0017-03

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)項(xiàng)目（2013B021800162）；佛山醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目（201308180）

陳水昌，副主任醫(yī)師，E-mail：nhqtcm@163.com