柯斌榕，盧政輝，吳小平，郭麗羨，蘭清秀

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州3500014；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建福州350002）

紫芝擔(dān)孢子交配型的鑒定*

柯斌榕1，盧政輝1，吳小平2**，郭麗羨2，蘭清秀1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州3500014；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建福州350002）

以紫芝（Ganoderma sinense）的擔(dān)孢子萌發(fā)獲得的單核菌株為試驗(yàn)材料，采用三輪雜交法、OWE-SOJ技術(shù)及核遷移技術(shù)對其擔(dān)孢子單核體交配型因子進(jìn)行準(zhǔn)確測定。結(jié)果表明，紫芝為四級性異宗結(jié)合菌類，其原生質(zhì)體單核化菌株交配型分離比例符合1:1的預(yù)期，不同交配型擔(dān)孢子的單核體符合1:1:1:1的自由分離規(guī)律，采用OWE-SOJ與核遷移試驗(yàn)相互印證，可以對紫芝擔(dān)孢子交配型進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

紫芝；交配型；四級性；核遷移；OWE-SOJ

紫芝（Ganoderma sinense J.D.Zhao,L.W.Hsu& X.Q.Zhang）又名黑芝、中國靈芝，是中國特有的一個(gè)靈芝種類，并由我國靈芝分類專家趙繼鼎先生首次命名[1-2]。作為傳統(tǒng)的藥用靈芝品種，與赤芝和松杉靈芝一起收錄入《中國藥典》中并得到廣泛使用[3]。紫芝味甘、性溫，較赤芝而言苦味較輕，含有多種活性成分，如多糖、靈芝酸、生物堿等，具有安神、消炎、利尿等功效。

目前紫芝研究主要側(cè)重于功效成分和藥理研究，而在遺傳育種研究方面則鮮有報(bào)道。栽培的紫芝菌種也主要以野生分離馴化為主，目前審定的唯一一個(gè)紫芝品種“武芝2號(hào)”也是通過野生馴化而得到的[4]。劉新銳等[5]通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)測定了紫芝的不親和性因子，表明紫芝具有豐富的不親和性因子，但未就擔(dān)孢子單核體的交配因子進(jìn)行分析。由于擔(dān)孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，含有豐富的遺傳變異因子。對紫芝擔(dān)孢子單核體交配型進(jìn)行研究，不僅有助于了解紫芝的生活史，也為新品種改良和雜交育種提供實(shí)驗(yàn)材料。本文通過對紫芝擔(dān)孢子單核體進(jìn)行紫芝交配型因子的研究，擬為將來利用擔(dān)孢子單核體的遺傳多樣性進(jìn)行雜交育種打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株紫芝由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.2培養(yǎng)基

PDA：土豆200 g，1 000 g水煮沸后過濾，2%瓊脂條煮沸后加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，然后制備試管斜面。

OWE培養(yǎng)基：5%雜木屑浸汁200 mL，瓊脂20 g，加蒸餾水補(bǔ)至1 000 mL。5%雜木屑浸汁制備，取50 g雜木屑于1 L水中煮60 min，過濾去雜質(zhì)加蒸餾水補(bǔ)足1 L。

SOJ培養(yǎng)基：鮮榨橘汁200 mL，121℃高壓滅菌30 min，使用時(shí)取20 mL，加入180 mL融化的水瓊脂中倒平板備用。

1.3擔(dān)孢子收集及單核體分離

選取新鮮剛開始彈射的紫芝子實(shí)體，采取活體套袋收集擔(dān)孢子的方法進(jìn)行收集。將當(dāng)天收集的擔(dān)孢子，常規(guī)稀釋至100倍，在顯微鏡視野中有10個(gè)～20個(gè)孢子即可，并涂布到PDA培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)，隨時(shí)觀察擔(dān)孢子萌發(fā)情況[6]。當(dāng)有擔(dān)孢子萌發(fā)，即可按謝寶貴[7]的方法挑取，并鏡檢獲取孢子單核體。

1.4標(biāo)準(zhǔn)測交菌株制備

標(biāo)準(zhǔn)菌株采用原生質(zhì)體單核化制備，方法參考吳小平等[8]制備赤芝原生質(zhì)體的方法，對再生的菌株進(jìn)行鏡檢，選取無鎖狀聯(lián)合的單核體作為標(biāo)準(zhǔn)測交菌株[8]。隨機(jī)選取一個(gè)單核菌株為T1，交配型定為AxBx；將能與其親和配對的單核菌株定為T2，交配型定為AyBy，并將其作為標(biāo)準(zhǔn)測交菌株。

1.5交配型分析

采用三輪雜交法進(jìn)行常規(guī)交配型分析[9]，以標(biāo)準(zhǔn)菌株T1和T2作為測試菌株，將孢子單核體作為待測菌株進(jìn)行配對，以鎖狀聯(lián)合為標(biāo)記進(jìn)行親和與否的判定，以此進(jìn)行單核體的交配型分析，與標(biāo)準(zhǔn)測交菌株均不親和的任選一個(gè)為測交菌株T3，將與T3親和的菌株定為T4。

1.6交配型χ2測驗(yàn)

通過卡方測驗(yàn)對原生質(zhì)體單核化菌株及4種擔(dān)孢子萌發(fā)的單核體進(jìn)行檢測，驗(yàn)證不同交配型的單核體的比例是否符合預(yù)期原生質(zhì)體單核化單核體1∶1及孢子單核體1∶1∶1∶1的比例[10]。

1.7單核菌株交配型準(zhǔn)確測定

1.7.1OWE-SOJ反應(yīng)

參考Darmono TW的方法將4種交配型T1、T2、T3、T4兩兩配對接種于OWE培養(yǎng)基上，兩接種塊間相距約0.5 cm。25℃對峙培養(yǎng)7 d～10 d。當(dāng)接種塊菌絲接觸后，將兩接種塊沿配對區(qū)垂直整條切出寬4 mm，長1.5 cm的瓊脂條，轉(zhuǎn)接入SOJ培養(yǎng)基中。25℃培養(yǎng)10 d～15 d觀察菌落形態(tài)。如果出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落，為A=B≠的反應(yīng)；出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落，則為A≠B=的反應(yīng)[11]。

1.7.2核遷移測定

四級性的異宗結(jié)合交配系統(tǒng)，是由A和B兩個(gè)交配型因子控制。當(dāng)2個(gè)單核菌株A因子相同B因子不同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)核遷移現(xiàn)象，但不形成鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。具體操作步驟參考陳莉[12]的方法，取單核菌株T1分別與T3及T4菌株進(jìn)行第一次配對。待菌絲交接后，取T1外側(cè)的菌塊與T4配對，取T3外側(cè)的菌塊與T2配對。觀察第二次配對是否可親和，如果可親和，則T1與T3間存在核遷移，其B因子不相同。反之則T1與T3間無核遷移，由此可以推測T3和T4的交配型。

2　結(jié)果與分析

2.1紫芝子實(shí)體及擔(dān)孢子形態(tài)

紫芝子實(shí)體及擔(dān)孢子形態(tài)見圖1。

圖1　紫芝子實(shí)體及擔(dān)孢子形態(tài)Fig.1Fruit body and basidiospores morphologies of Ganoderma sinense

由圖1可見，紫芝子實(shí)體呈半圓形、腎形或如意形，人工段木栽培條件下也常呈現(xiàn)近圓形；子實(shí)體皮殼成紫黑色，具有漆樣光澤；菌蓋表面有同心環(huán)紋。菌管層表面呈淺褐色，成熟后則呈褐色。菌柄側(cè)生，同菌蓋類似具有漆樣光澤。紫芝擔(dān)孢子呈卵形，相較赤芝擔(dān)孢子要大。頂端呈臍突形，或稍平截，雙層壁，外壁透明，內(nèi)壁平滑，內(nèi)壁淡褐色有明顯小刺，成熟擔(dān)孢子大小為（10～12）μm×（6.5～8.0）μm。

2.2標(biāo)準(zhǔn)測交菌株及擔(dān)孢子單核體分離

單核體菌株分離見圖2。

圖2　單核體菌株分離Fig.2Obtained monokaryogenesis

通過原生質(zhì)體再生，共挑取了50個(gè)再生菌株，經(jīng)鏡檢篩選獲得了29個(gè)單核菌株，單核化率為58.00%。試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)紫芝的原生質(zhì)體單核化率與制作原生質(zhì)體所采用的菌絲培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系密切，幼嫩的菌絲體更易再生且獲得單核菌株。利用擔(dān)孢子萌發(fā)的方式，共獲得紫芝孢子單核體31個(gè)。因?yàn)閾?dān)孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，存在廣泛的變異，具體表現(xiàn)在不同單核菌株間生長速度和菌落形態(tài)存在明顯差異。

2.3交配型結(jié)果分析

通過親和配對，將原生質(zhì)體單核化獲得的單核菌株分為T1和T2兩類，并以其作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行孢子單核體的親和配對。通過常規(guī)三輪雜交配對，結(jié)果見表1。

由表1可見，通過χ2驗(yàn)證表明，原生質(zhì)體單核化2種交配型的分離比例符合預(yù)期，孢子單核體的分離比例也符合1∶1∶1∶1的自由分離定律。

2.4交配型準(zhǔn)確測定結(jié)果

表1　紫芝原生質(zhì)體單核化及單核菌株的交配型分析Tab.1Analysis on mating type of monokaryons

通過OWE-SOJ技術(shù)進(jìn)行不同孢子單核體間的配對，見圖3。從圖3可以觀察到3種不同的結(jié)果，無鎖狀聯(lián)合的柵欄菌落、有鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落和無鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落。通過不同交配型因子的單核體間配對反應(yīng)類型的不同，可以推測出T3和T4的交配型應(yīng)為AXBY和AYBX。

圖3　不同孢子單核體配對的OWE-SOJ反應(yīng)類型Fig.3Interaction types of confrontation culture of different monospores using OWE-SOJ technique

利用核遷移技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證OWE-SOJ反應(yīng)的結(jié)果，再次驗(yàn)證T3和T4的交配型，結(jié)果見圖4。

圖4　紫芝單核菌絲的核遷移Fig.4Nuclear migration of Ganoderma sinense

由圖4可見，將T1與T3進(jìn)行第一次配對后，再與不親和的T4和T2進(jìn)行配對，通過鏡檢第二次配對發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，所以可以推斷T1和T3、T2和T4之間存在核遷移現(xiàn)象，T1和T4、T2和T3之間不存在核遷移。因此可以推定紫芝4種孢子單核體的準(zhǔn)確交配型為：T1（AXBX）、T2（AyBy）、T3（AXBY）和T4（AYBX）。

3　討論

紫芝為四級性異宗結(jié)合菌類，其交配型受兩對獨(dú)立的交配型因子控制。其中交配型因子A控制菌絲融合和鎖狀聯(lián)合的形成，B因子則控制細(xì)胞核遷移。擔(dān)孢子萌發(fā)獲得的單核體根據(jù)交配型不同可以分為四類，通過與標(biāo)準(zhǔn)測交菌株配對可以獲得親本型和非親本型的單核體。本研究獲得的孢子單核體符合預(yù)期的自由分離比例，但非親本型的單核體多于親本型，這可能與擔(dān)孢子的萌發(fā)率或挑取的單核體數(shù)量不足有關(guān)。陳裕新等[13]發(fā)現(xiàn)可以使用OWESOJ技術(shù)研究赤芝交配型因子。本研究采用OWESOJ技術(shù)與和遷移技術(shù)相結(jié)合，既可以克服OWESOJ反應(yīng)中反應(yīng)形態(tài)不夠明顯，也可以解決核遷移試驗(yàn)中鎖狀聯(lián)合不易觀察的問題[13]。二者相互驗(yàn)證可以準(zhǔn)確測定T3和T4的交配型，為下一步開展品種選育與改良試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

本研究并沒有發(fā)現(xiàn)重組型的交配型因子出現(xiàn)，這可能與交配型因子中各亞基的距離較近，重組率較低有關(guān)。隨著全基因組測序工作的開展，赤芝的交配型因子結(jié)構(gòu)已經(jīng)繪制，這將有助于指導(dǎo)交配型因子的深入研究[14]。同時(shí)研究過程中發(fā)現(xiàn)，不同的孢子單核體在菌落形態(tài)、生長速度等方面具有多態(tài)性。孢子單核體遺傳多樣性的深入研究，將有助于挖掘品種特性，并應(yīng)用于紫芝品種改良和遺傳研究。

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Accurate Determination of Mating Type of Ganoderma sinense Basidispores

KE Bin-rong1,LU Zheng-hui1,WU Xiao-ping2,GUO Li-xian2,LAN Qing-xiu1
（1.Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences,National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding&Cultivation of Featured Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,China; 2.Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China）

Four mating types of basidispores from Ganderma sinense were determined using three-cycle mating system,OWESOJ technique and nuclear migration test.Test results showed that G.sinense was a kind of basidiomycete with tetrapolarity heterothallism.The different mating types of protoplasted monokaryon and basidispores were present in a 1:1 and 1:1:1:1 ratio. The nuclear migration test is consist with that of OWE-SOJ,and they could establish corroboration for each other.Therefore it was feasible to apply this method to determine the mating type of basidispores accurately.

Ganoderma sinense;mating type;tetrapolarity;nuclear migration;OWE-SOJ

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0024-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.006

福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程專項(xiàng)項(xiàng)目（2014S1477-21)；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大農(nóng)技推廣服務(wù)試點(diǎn)項(xiàng)目（KNJ153013)。

柯斌榕（1986-），男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事食（藥）用菌栽培及育種。E-mail:kebinrong@qq.com

**通信作者：吳小平（1965-），男，博士，教授，主要從事食用菌教學(xué)與科研工作。E-mail:fjwxp@126.com

2016-05-28