羅生金，張 磊，阿不都力·尼亞孜，李文彩，馬春江

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密839000）

薩?？搜虺盘幚砼c胚胎移植技術(shù)應(yīng)用研究

羅生金，張 磊，阿不都力·尼亞孜，李文彩，馬春江

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密839000）

2015年11月至12月筆者在新疆哈密市牧祥合作社開(kāi)展綿羊鮮胚移植，對(duì)合作社提供的87只供體羊采用自然觀察法選取55只，通過(guò)PG注射同期發(fā)情處理，再采用FSH遞減法超排技術(shù)。研究結(jié)果表明：55只供體羊共沖胚胎675枚，可用胚胎575枚。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)15月齡羊10只沖胚胎94枚，可用胚胎70枚；24月齡羊45只沖胚胎581枚，可用胚胎505枚，差異均極顯著（P＜0.01）。按胎次分組經(jīng)產(chǎn)羊44只沖胚胎578枚，可用胚胎495枚，11只初產(chǎn)羊沖胚胎97枚，可用胚胎80枚，兩者差異極顯著（P＜0.01）。受體羊采用兩次注射PG法同期處理母羊450只，發(fā)情410只，發(fā)情率91%，移植392只，受體羊可利用率95.6%。將575枚可用胚胎移植給392只受體羊，移植受胎率達(dá)64.03%。但從處理的392只不同品種受體羊移植受孕率來(lái)看，多浪羊略低，但湖羊、小尾寒羊、湖哈雜交羊間受孕率差異均不顯著（P＞0.05）。從胚胎類(lèi)型上看，桑葚胚受孕64.9%，囊胚受孕55.0%，說(shuō)明受體羊與供體羊子宮處于同一環(huán)境中收集6 d胚胎，移植桑葚胚受孕率較高。在胚胎移植質(zhì)量上看，移植A級(jí)胚胎受胎率明顯高于B、C級(jí)胚胎，且胚胎利用率差異顯著（P＜0.05）。

薩?？搜?；超數(shù)排卵；鮮胚移植；妊檢

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體羊預(yù)處理 選取新疆哈密市牧祥合作社種羊場(chǎng)提供的薩?？四秆?7只做供體羊，體重70～75 kg，年齡15～24月齡，膘情中等以上。準(zhǔn)備期每只羊日喂青干草1 kg，玉米青貯1.5 kg，混合精料0.5 kg，磷酸氫鈣10 g，食鹽9 g。按程序做好飼喂、飲水、運(yùn)動(dòng)、試情等工作。預(yù)處理期與超排處理前每只羊分別注射一次亞硒酸鈉VE（3 mL）和VAD（5 mL）。種公羊?yàn)楸緢?chǎng)18～24月齡薩福克羊，遺傳性能穩(wěn)定，系譜清晰，體形外貌均達(dá)到了品種標(biāo)準(zhǔn)，體格結(jié)實(shí)，健康無(wú)病，雄性特征明顯，精液品質(zhì)良好，膘情8成以上。

1.1.2 受體羊預(yù)處理 受體羊?yàn)楸緢?chǎng)多浪羊、小尾寒羊、湖羊、湖哈雜交羊，無(wú)繁殖性疾病及傳染病，經(jīng)檢測(cè)布病均為陰性。年齡1.5～4歲，均為經(jīng)產(chǎn)母羊。母羊體格健壯，體重40 kg以上，膘情中等。處理前2個(gè)月做好疫病免疫與驅(qū)蟲(chóng)工作，然后佩戴耳標(biāo)，分群飼養(yǎng)，確保受體羊整體質(zhì)量。試情公羊?yàn)楸緢?chǎng)調(diào)教后的健康無(wú)病、性欲好的成年湖羊。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備 專(zhuān)用胚胎移植手術(shù)架，內(nèi)窺鏡，B超儀，子宮鉗，體視顯微鏡，水浴鍋，恒溫臺(tái)，注射器（1mL、2.5mL、5 mL、20 mL、50 mL），沖卵管，三通管，檢卵（胚）針，移植管，培養(yǎng)皿，曲別針，小彎縫合針，12號(hào)縫合線，剃毛刀，剪毛剪，電暖器，等等。

1.1.4 試驗(yàn)藥品 沖卵液（PBS）由中國(guó)農(nóng)科院研制生產(chǎn)，保存液（holdingsolution）新西蘭生產(chǎn)；前列醇鈉、FSH、LHRH-A3均為寧波三生激素制品廠生產(chǎn)；靜松靈注射液，利多卡因注射液，黃體酮注射液，160萬(wàn)IU青霉素，100萬(wàn)IU鏈霉素，100mL替硝唑注射液。

1.2 方法

1.2.1 供體羊超排技術(shù) 2015年11月對(duì)供體羊采用自然觀察法，用試情公羊試情一個(gè)情期，對(duì)于有自然發(fā)情的母羊再進(jìn)行同期發(fā)情處理。首先對(duì)自然發(fā)情的55只供體羊全群注射PG1 mL/只，在24～72 h內(nèi)每天試情2次，做好發(fā)情記錄，按照發(fā)情先后順序分組、編制程序，在母羊情期10～11 d采用FSH逐日遞減法進(jìn)行超排處理，見(jiàn)表1。

表1 超排處理程序

1.2.2 受體羊同期處理 對(duì)受體羊第1次注射PG時(shí)與供體羊同步，第2次注射PG時(shí)比供體羊提前12 h，便于鮮胚移植時(shí)調(diào)配受體羊。依據(jù)供體羊分組編號(hào)數(shù)量與順序，按照1:8配備受體羊，第2次注射后24～72 h觀察發(fā)情狀況，并做好標(biāo)記與記錄備用。

1.2.3 供體羊胚胎獲取 供體羊配種后第5～6.5天進(jìn)行手術(shù)法沖卵。首先將供體羊采取前低后高半仰臥姿勢(shì)保定在手術(shù)架上，術(shù)部剃毛—備皮—消毒，切開(kāi)皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，最后打開(kāi)腹膜，創(chuàng)口3～4 cm。蓋上創(chuàng)巾，使切口暴露于創(chuàng)巾中部。術(shù)者將食指和中指由切口伸入腹腔，在與骨盆交界的前后位置觸摸子宮角，找到后用二指夾持，牽出創(chuàng)口外。創(chuàng)口要用被生理鹽水浸濕的紗布圍住，循子宮角至該側(cè)輸卵管找到卵巢，觀察黃體發(fā)育良好，選擇在子宮角基部扎孔，將沖卵管插入，用注射器注入5～6 mL氣體，使氣囊適度充滿氣并固定，另一端接集卵器。在子宮角的尖端插入套管針，連接吸有50 mL、溫度在37℃的沖胚液，緩緩注入，使沖胚液流向子宮角后回流到集卵器；另一側(cè)子宮角以同樣方法沖洗。用集卵器集卵，留少量沖胚液以便檢胚。沖胚后為防止粘連，將子宮角用100 mL替硝唑沖洗后送入腹腔，并向腹腔注入37℃100 mL替硝唑注射液+160萬(wàn)IU青霉素+100 IU鏈霉素，按手術(shù)常規(guī)處理，閉合腹腔。

1.2.4 胚胎鑒定與保存 在羊場(chǎng)設(shè)立實(shí)驗(yàn)室，采用電暖氣供熱，溫度保持在25℃，取3個(gè)培養(yǎng)皿放置于29℃恒溫臺(tái)上，加入適量保存液備用。將收集好的沖卵液移去上層液，取底部少量液體移至平皿內(nèi)，靜置后，在體視鏡20～40倍下檢查胚胎數(shù)量，觀察胚胎質(zhì)量?？捎门咛?級(jí)：發(fā)育正常，胚齡與發(fā)育期相吻合，卵裂球輪廓清楚，明暗度適中，細(xì)胞密度大，卵裂均勻，細(xì)胞變性率不超過(guò)10%；2級(jí)：胚齡與發(fā)育期基本吻合，輪廓清楚，明暗度適中或稍淡，細(xì)胞密度較小，細(xì)胞變性率10%～20%；3級(jí)：輪廓不清楚，色澤過(guò)暗或過(guò)淡，細(xì)胞細(xì)胞變性率30%～40%［2］。根據(jù)胚胎鑒定結(jié)果做好記錄并保存胚胎。1級(jí)胚胎可單獨(dú)移植，2級(jí)胚胎和3級(jí)胚胎搭配進(jìn)行移植。

1.2.5 腹腔鏡法胚胎移植 將受體羊保定在手術(shù)架上剃毛—備皮—消毒后，羊體置于70°～80°傾斜倒立保定，在據(jù)乳房前下方7～11cm、離腹中線5cm處各切開(kāi)1.0～1.5cm的切口，一側(cè)套管針刺入腹腔后，抽出針芯，將觀察鏡經(jīng)管套送入腹腔，另一側(cè)插入子宮鉗，一只手固定觀察鏡，另一只手拿子宮鉗翻動(dòng)、撥開(kāi)卵巢系膜，暴露卵巢，通過(guò)目鏡觀察黃體發(fā)育情況，按突出卵巢的直徑和顏色分為優(yōu)、中、差3個(gè)等級(jí)。優(yōu)：0.6～0.8cm，顏色深紅；中：0.5cm，顏色鮮紅；差：0.3 cm，顏色粉紅。將判定合格黃體一側(cè)的子宮角前端用子宮鉗引出腹腔切口外，用曲別針避開(kāi)血管在子宮角前端扎孔，用裝好胚胎的移植針，斜向子宮角方向扎入子宮腔內(nèi)，注入胚胎，移植后將子宮角恢復(fù)原位，切口縫合1針，對(duì)于中級(jí)黃體注射黃體酮10～20mg，解除保定。

1.2.6 術(shù)后處理 供體羊術(shù)后肌注PG1 mL，為防止粘連對(duì)供體羊適當(dāng)放牧，歸牧后圈舍應(yīng)保持干燥、清潔，加強(qiáng)護(hù)理，防止感染，按照肉羊營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整日糧，1月后開(kāi)始配種。

1.2.7 妊娠檢查 在受體羊妊娠35日齡時(shí)，經(jīng)B超檢查妊娠251只，受胎率64.03%。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體羊沖胚情況

本次處理供體羊55只，沖胚675枚，可用胚胎575枚。其中有1只供體羊沖出胚胎57枚，可用胚胎53枚，移植受體羊46只，受胎率71.7%（33/46）。初產(chǎn)羊：有1只出現(xiàn)先天性子宮畸形未沖出胚胎，1只羊黃體發(fā)育不好，有退化現(xiàn)象沒(méi)有做沖胚胎。經(jīng)產(chǎn)羊有1只卵巢有16個(gè)黃體僅沖出1枚胚胎，可能是在沖胚方面沒(méi)有沖完全，亦或卵巢超排過(guò)大，排出的卵子未能進(jìn)入輸卵管傘而丟失，有待今后進(jìn)一步研究。

在同樣的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，10只供體羊在15月齡回收胚胎平均9.40枚，可用胚胎平均7.00枚；45只24月齡供體回收胚胎平均12.91枚，可用胚胎平均11.22枚，兩者差異均極顯著（P＜0.01），見(jiàn)表2。11只初產(chǎn)供體回收胚胎平均8.82枚，可用胚胎平均7.27枚；44只經(jīng)產(chǎn)供體回收胚胎平均13.13枚，可用胚胎平均11.25枚，兩者差異均極顯著（P＜0.01），見(jiàn)表3。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：有過(guò)產(chǎn)羔史、年齡在2周歲以上、膘情中等以上、健康無(wú)病的羊做供體羊效果會(huì)更好。

表2 不同年齡供體羊胚胎數(shù)量比較

表3 不同胎次供體羊胚胎數(shù)量比較

2.2 不同受體羊同期發(fā)情效果與胚胎利用狀況

對(duì)450只受體羊進(jìn)行兩次PG同期發(fā)情處理，發(fā)情410只，同期發(fā)情率達(dá)91%。將575枚可用胚胎移至392只受體羊，受體羊可利用率95.6%，移植成功率達(dá)64.03%。但從處理的392只不同品種受體羊移植情況看，多浪羊受胎率略低，但差異均不顯著（P＞0.05），見(jiàn)表4。小尾寒羊、湖羊、雜交羊受胎率較高，主要原因在于移植時(shí)這些品種羊卵巢上有較多的黃體正在發(fā)育，為胚胎著床提供了良好環(huán)境。

表4 不同受體羊同期發(fā)情與移植情況

2.3 胚胎類(lèi)型、胚胎質(zhì)量對(duì)受胎率的影響

這次鮮胚移植，沖出可用胚胎575枚，共移植至392只受體羊，桑葚胚受孕率64.9%，囊胚受孕率55.0%，細(xì)胞體受孕率25.0%，表明受體羊與供體羊在同一環(huán)境下移植桑葚胚受孕率較高，此結(jié)果與柳占奇［3］報(bào)道一致。從胚胎移植質(zhì)量上看，移植A級(jí)胚胎受胎率明顯高于B、C級(jí)胚胎。詳見(jiàn)表5、表6。

表5 胚胎類(lèi)型對(duì)受胎率的影響

表6 移植胚胎數(shù)、胚胎質(zhì)量對(duì)受胎率的影響

3 討論

（1）本次胚胎移植對(duì)供體羊處理采用自然交配方式進(jìn)行，采用上午發(fā)情，下午配種，下午發(fā)情第2天早晨配種，發(fā)情后第一次配種后肌注半支LHRH-A3，每只羊配種2～3次，由于種公羊充足，僅有1只初產(chǎn)羊未出現(xiàn)受精現(xiàn)象，可能是卵子未發(fā)育成熟等原因，有待于今后進(jìn)一步驗(yàn)證。

（2）早期胚胎在一定時(shí)間內(nèi)處于游離狀態(tài)、無(wú)排異性等特性，是胚胎移植建立的生理基礎(chǔ)，但胚胎移植受孕要求供體和受體在種屬上、生理上、胚胎收集和移植部位上必須一致，才使胚胎移植成活成為可能［4］。本次移植受體羊品種屬于常年性發(fā)情羊，采用2次注射PG法進(jìn)行同期發(fā)情處理，同期率達(dá)91%，受體羊利用率達(dá)95.6%，受胎率取得較好效果。

（3）本次供體羊采用自然觀察法結(jié)合PG注射法，再用FSH遞減法對(duì)綿羊進(jìn)行超排處理，是一種有效的處理方法。

［1］ 國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源志羊志［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：223-224.

［2］ NY/T1571—2007.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［S］.羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程.

［3］ 柳占奇.牛羊胚胎移植技術(shù)推廣及影響受體羊利用率、妊娠率的因素分析［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［4］ 邵慶勇，趙志勇，楊紅遠(yuǎn)，等.彌勒紅骨山羊重復(fù)超數(shù)排卵及胚胎移植研究［C］//全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集.蘭州：中國(guó)草食動(dòng)物編輯部，2012：255-257.

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2095-3887（2016）02-0026-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.007隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，高質(zhì)量羊肉的需求與日俱增。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)目前的羊肉生產(chǎn)還存在產(chǎn)量低、肉質(zhì)差等突出問(wèn)題，在國(guó)際市場(chǎng)上缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。薩?？搜颍⊿uffolk）原產(chǎn)于英國(guó)，具有早熟、生長(zhǎng)發(fā)育快、體格大的特點(diǎn)。其成年公羊體重100～136 kg，成年母羊體重70～96kg，是生產(chǎn)大胴體和優(yōu)質(zhì)羔羊肉的理想品種。美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞等國(guó)都將該品種作為生產(chǎn)肉羔的終端父本品種［1］。因此，2015年2月新疆哈密市牧祥合作社種羊場(chǎng)從澳大利亞引進(jìn)了薩福克肉羊100只，在同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下進(jìn)行了誘導(dǎo)發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎鑒定、胚胎移植等的系統(tǒng)研究，以期總結(jié)出適合本地區(qū)推廣應(yīng)用的肉羊超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)的操作規(guī)程，為推動(dòng)本地區(qū)胚胎移植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

2015-02-02

哈密地區(qū)科技興農(nóng)項(xiàng)目——國(guó)外專(zhuān)用肉羊胚胎移植推廣項(xiàng)目

羅生金（1973-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士。

馬春江（1972-），男，農(nóng)業(yè)推廣研究員，本科，主要從事畜牧業(yè)新技術(shù)推廣工作。