伍旭明，許亞萍

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310006）

·技術(shù)與方法·

超聲波-微波協(xié)同提取苦豆子中氧化苦參堿

伍旭明，許亞萍

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310006）

目的：對苦豆子中氧化苦參堿進(jìn)行超聲波和微波雙輔助提取工藝的研究。方法：以氧化苦參堿提取率為考察對象，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率及輻射時(shí)間等因素對提取率的影響。結(jié)果：用正交試驗(yàn)方法獲得了優(yōu)化的提取工藝，采用超聲波和微波雙輔助提取技術(shù)得到的提取效率較傳統(tǒng)提取方法和單獨(dú)輔助方法高。最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間3 min、微波功率500 W、固液比1∶15（g/mL）。結(jié)論：超聲波-微波協(xié)同提取方法簡單可靠、效率高，適宜大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。

苦豆子；超聲；微波；氧化苦參堿；提取率

氧化苦參堿是一種喹諾里西啶類天然生物堿，是中藥苦參、維藥苦豆子的主要活性藥物成分[1]，臨床應(yīng)用中具有保肝、抗肝纖維化、抗腫瘤等功能[2]， 是治療慢性乙型肝炎五類新藥，同時(shí)還具有抑制和殺滅微生物的藥理活性，且低毒、低殘留，已被開發(fā)出作為多用途新型農(nóng)藥[3]。因此氧化苦參堿的需求量逐年增大，其來源已成為市場應(yīng)用的重要制約因素。

苦豆子是多年生草本植物，其中氧化苦參堿含量達(dá)2%以上[4]，我國的苦豆子總產(chǎn)量占世界的62%，總貯量超過10萬噸[5-7]，是氧化苦參堿的一個(gè)重要來源。本實(shí)驗(yàn)以苦豆子種子為提取原料，以氧化苦參堿含量作為評價(jià)指標(biāo)，采用超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)，對影響工藝的關(guān)鍵因素進(jìn)行考察，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，獲得了一種在常溫下快速簡便、高效地提取苦豆子氧化苦參堿成分的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器及藥劑 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（XZ-6A型，北京科龍儀器公司）；超聲-微波協(xié)同萃取儀（CW-2000型，配1 000 mL反應(yīng)器，上海新拓分析儀器科技有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent-1100型，安捷倫公司）；自動(dòng)進(jìn)樣儀（Agilent-1100型，安捷倫公司）；粉碎機(jī)（HX-FW-200型，北京恒奧德儀器儀表有限公司）；掃描電鏡（JSM6360LA，JEOL）；光學(xué)顯微鏡（CX41，奧林巴斯公司）；實(shí)驗(yàn)室純水儀（Elix Advantage型，密理博公司）等。

乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。水為純化去離子水。苦豆子干種子購自寧夏鹽池縣，于60 ℃下減壓干燥3 h，粉碎后過40目篩密封保存?zhèn)溆?；氧化苦參堿對照品（98%，成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法及方法學(xué)研究：本實(shí)驗(yàn)以氧化苦參堿的含量作為評價(jià)指標(biāo)，色譜條件參考文獻(xiàn)[8-11]， 色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（254×4.60mm）； 柱溫30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（0.2%磷酸+0.32%三乙 胺）（3:97），流速：1 mL/min；檢測波長：215 nm；進(jìn) 樣量10 μL。

精密稱取氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品25.04 mg用流動(dòng)相溶劑溶解并稀釋成濃度為2.5、1.5、0.5、0.25和0.05 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積對濃度進(jìn)行回歸，得回歸方程為：A= 23860.40X+83.21，r=0.9992，氧化苦參堿在0.05～2.5 mg/mL濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。提取率計(jì)算公式如下：

式中E為提取率；m為換算后提取液中氧化苦參堿質(zhì)量（g）；M為樣品質(zhì)量（g）。

取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定其峰面積，氧化苦參堿平均峰面積（RSD）為0.32% （n=6），因此儀器精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

取同一批次提取液做穩(wěn)定性測試，按上述色譜方法檢測，共6次分析其RSD為0.38%，表明樣品溶液在6 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

取同一批次提取液做重復(fù)性測試，按上述色譜方法檢測，共測6次分析其RSD為0.62%，說明方法重復(fù)性較好。

1.2.2 單因素試驗(yàn)：苦豆子中的生物堿及其鹽能溶于親水的乙醇和甲醇，但是甲醇毒性較大，多用乙醇作為提取溶劑。精確稱量1 g的苦豆子粉20份，分別置于相應(yīng)容積的反應(yīng)瓶中，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別單獨(dú)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%），微波提取功率（100、200、300、500、700 W），微波提取時(shí)間（1、3、5、7、10 min），液料比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:30）對提取率的影響，其中液料比是指提取溶劑體積與苦豆子粉重量的比值。

1.2.3 正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)參數(shù)范圍，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)L9（34）設(shè)計(jì)見表1，為書寫方便，將各因素以A、B、C、D代替。

精確稱量1 g的苦豆子粉加70%乙醇溶液30 mL， 圓底燒瓶中加熱回流，于0.5、1、2、3、4、6 h后取提取液測定氧化苦參堿的含量，作為對比試驗(yàn)[12]。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

1.2.4 對比實(shí)驗(yàn)：以乙醇為溶液，采用傳統(tǒng)常壓回流法對苦豆子原料進(jìn)行提取，觀察提取率。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 圖1為標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的液相色譜圖，停留時(shí)間為10.67 min為氧化苦參堿，在測試樣品中出現(xiàn)了停留時(shí)間為6.12 min的氧化苦參堿的吸收峰，由色譜峰可見各物質(zhì)的分離情況較好，相互之間沒有干擾。

圖1 氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品、樣品液相色譜圖

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響：在液料比1:20（g/mL），溫度50 ℃[8]，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）下，分別以300 W的微波輻射強(qiáng)度進(jìn)行提取，每隔1 min取樣測試得率，結(jié)果如圖2A所示。不同濃度的乙醇溶液的極性的不同，對提取率的影響很大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率逐步上升，達(dá)到70%時(shí)，其提取率達(dá)最大值，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，溶液的極性下降，導(dǎo)致提取率不升反降。因此，合適極性的溶液決定了提取率，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%較適合。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)因素對提取率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對提取率的影響：提取時(shí)間的延長可以強(qiáng)化超聲-微波協(xié)同提取的各種效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的破裂和有效成分的提取，但是微波和超聲也會(huì)促進(jìn)物質(zhì)的反應(yīng)和轉(zhuǎn)化，尤其是對于氧化苦參堿這種穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，合理的提取時(shí)間會(huì)直接決定提取的效率。選取液料比1:20（g/mL），加熱溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，以500 W的微波輻射強(qiáng)度進(jìn)行提取，得到提取率與提取時(shí)間（1、3、5、7、10 min）的關(guān)系如圖2B所示。在5 min以內(nèi)，隨著提取時(shí)間的上升，提取率也呈直線上升，但當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)5 min時(shí)，提取時(shí)間對提取率的改善效果已經(jīng)不明顯，當(dāng)提取時(shí)間超過7 min后，提取率有下降的趨勢。這應(yīng)該是隨著提取時(shí)間的增加，盡管溶液的溫度得到設(shè)備的控制，局部溫度的過熱和超聲-微波的協(xié)調(diào)作用仍促使氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為其他的物質(zhì)，因此提取時(shí)間不能過長。

2.1.3 提取功率對提取率的影響：本實(shí)驗(yàn)所用的超聲-微波協(xié)同提取儀的超聲波參數(shù)固定為功率/頻率：50 W/40 kHz，因此微波功率直接決定了超聲波-微波協(xié)同提取的各種效應(yīng)的強(qiáng)度，過高的功率不僅造成能源的浪費(fèi)，也會(huì)引起物質(zhì)的反應(yīng)和轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)中選取液料比1:20（g/mL），加熱溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，以不同功率（100、200、300、500、 700 W）的微波輻射強(qiáng)度進(jìn)行提取，得到提取率與輻射功率的關(guān)系。由圖2C可知，在該規(guī)模的提取體積下，當(dāng)提取功率到達(dá)300 W時(shí)，提取率已經(jīng)接近飽和，加大提取功率對提取率的影響有限，當(dāng)提取超過一定限度后，會(huì)導(dǎo)致氧化苦參堿的轉(zhuǎn)變，使提取率有一定的下降。

2.1.4 液料比對提取率的影響：提取物在溶液里有一定的溶解度，液料比直接決定了能否將活性物質(zhì)有效提取出來，過高的液料比會(huì)造成后處理成本的提高，同時(shí)會(huì)使提取溶液體積過大，降低微波和超聲分散效果。試驗(yàn)中在溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，500 W功率的微波輻射強(qiáng)度下，以不同的液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、30:1）進(jìn)行提取，圖2D顯示，過低的液料比無法對苦豆子中的氧化苦參堿實(shí)現(xiàn)有效的提取，當(dāng)液料比達(dá)到1:15（g/mL）后，提取效果接近飽和，液料比達(dá)到1:20（g/mL）后，增大液料比已經(jīng)對提取率沒有影響，因此在單因素試驗(yàn)中，將液料比限定為1:20（g/mL）。

2.2 正交試驗(yàn) 由表2和表3試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可知，各因素影響的主次為B＞C＞A＞D，最佳條件為B2C3A2D1，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、功率都對提取結(jié)果有顯著影響，時(shí)間對提取率的影響最大，因此在過程中需要控制提取時(shí)間以避免氧化苦參堿的變性。因此可以得到正交試驗(yàn)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間3 min、微波功率500 W、固液比1:15（g/mL）。按該優(yōu)化條件試驗(yàn)，得到提取率為1.78%。為了驗(yàn)證該工藝的可靠性，在最佳工藝條件下重復(fù)提取3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，多次不同提取原料量的提取平均得率為1.78%，因此該提取工藝具有較好的重復(fù)性、操作性和穩(wěn)定性。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3 對比實(shí)驗(yàn) 傳統(tǒng)的常壓回流提取方法對苦豆子原料進(jìn)行提取，其結(jié)果顯示在提取時(shí)間為4 h時(shí)，提取率達(dá)到最高為（1.43%），隨著時(shí)間的延長，氧化苦參堿的提取率逐漸降低。見圖3。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 傳統(tǒng)提取方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

苦豆子是我國西北地區(qū)常見的廣泛分布的野生植物，其不僅耐干旱和貧瘠，在地下水位高的輕鹽化沙地也能夠維持良好的生長態(tài)勢，植株的各器官中氧化苦參堿含量均相當(dāng)可觀[13]。在苦參資源有限的情況下，苦豆子、狼牙刺這些西北地區(qū)的獨(dú)特植物將是擴(kuò)大氧化苦參堿來源的重要資源。尤其苦豆子在我國分布廣泛，研究和發(fā)展從苦豆子中提取氧化苦參堿的技術(shù)，對于開發(fā)苦豆子資源價(jià)值，拓展氧化苦參堿來源具有重要的意義。

從藥用植物中提取有效活性成分是個(gè)復(fù)雜的過程，除了常用的溶劑萃取法，超聲、微波以及超聲波-微波協(xié)同萃取技術(shù)等也被用來強(qiáng)化萃取過程[6-7]。 超聲波-微波協(xié)同萃取技術(shù)是結(jié)合超聲振動(dòng)與開放式微波的高效過程，既具有超聲時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)和攪拌作用，也具有微波技術(shù)的高能作用，能避免單一的超聲技術(shù)熱效應(yīng)差、微波輔助加熱不均等問題。該技術(shù)提取時(shí)間短、提取溫度低，可有效地避免活性成分變性，因此在提取效率、操作難度、穩(wěn)定性等方面都有巨大的優(yōu)勢。

傳統(tǒng)從苦豆子中提取氧化苦參堿常使用冷浸法、加熱回流等方法[8]，這些方法不僅效率低、時(shí)間長，另外研究結(jié)果表明提取溫度和時(shí)間是氧化苦參堿向苦參堿轉(zhuǎn)化[9-10]的主要影響因素，因此需要研究如何在較低溫度下迅速地提取氧化苦參堿。盡管有文獻(xiàn)[11]采用超聲或微波方法提取苦豆子中的生物總堿，但是以氧化苦參堿為目標(biāo)物的協(xié)同輔助提取方法仍未見報(bào)道。

本文中以氧化苦參堿為提取目標(biāo)物，系統(tǒng)地研究了從苦豆子的超聲波-微波輔助提取工藝，得到了優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間3 min、微波功率500 W、固液比1:15（g/mL）。與傳統(tǒng)的常壓回流提取方法和單獨(dú)輔助提取方法[14]相比，在相同條件下，氧化苦參堿的提取時(shí)間大大縮短，有效提取率升高了24.5%，且在提取過程中未使用涉及到蒸發(fā)、減壓[8]等高能耗的復(fù)雜操作，具有優(yōu)良的節(jié)能效果，適用于工業(yè)化、低成本生產(chǎn)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Extraction process of oxymatrine from sophora alopecuroides L. using ultrasonic-microwave synergis-tic extraction

WU Xuming, XU Yaping. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou, 310006

Objective: To study the ultrasonic-microwave assisted extraction of oxymatrine from sophora alopecuroides L. Methods: The extraction process of oxymatrine was investigated with ethanol concentration, solid-solvent ratio, microwave power and irradiation time. Results: Optimized process was obtained by using orthogonal rotation design method with higher extraction efficiency than that using conventional and individual extraction technologies. The results showed that the optimum condition was as following： ethanol concentration 70%, extraction time 40 min, microwave power 500 W, and the solid-solvent ratio 1：15 (g/mL). Conclusion: The ultrasonic-microwave synergistic extraction technology has advantages of reliability, extracting efficient, and is suitable for industrial application.

sophora alopecuroides L.； ultrasonic； microwave； oxymatrine； extraction yield

R284.2

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.010

2015-12-02

伍旭明（1976-），男，浙江臨安人，主管中藥師。