邱陽(yáng)，陳曉雅，孫崢嶸，胡冰青，徐品一，崔磊，李玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.內(nèi)分泌科；2.病毒室，沈陽(yáng) 110004）

原肌球蛋白3與雄激素受體配體結(jié)合域之間的相互作用

邱陽(yáng)1，陳曉雅1，孫崢嶸2，胡冰青1，徐品一1，崔磊1，李玲1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.內(nèi)分泌科；2.病毒室，沈陽(yáng) 110004）

目的為明確雄激素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及機(jī)制，在單核細(xì)胞內(nèi)篩選與雄激素受體結(jié)合的蛋白。方法將雄激素受體配體結(jié)合域（AR?LBD）做為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選與AR?LBD相互作用的蛋白，進(jìn)一步應(yīng)用Pull?down、免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證二者在體外的相互作用。結(jié)果從男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出原肌球蛋白3（TPM3）與AR?LBD存在相互作用。在體外通過(guò)Pull?down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TPM3與AR?LBD的相互作用，進(jìn)一步通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)免疫熒光確認(rèn)TPM3與AR?LBD在293HEK細(xì)胞中重疊共表達(dá)。結(jié)論在男性外周血單核細(xì)胞內(nèi)，TPM3與AR?LBD存在相互作用。

雄激素受體；原肌球蛋白；單核細(xì)胞；酵母雙雜交；動(dòng)脈粥樣硬化

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雄激素在男性生殖和性功能、紅細(xì)胞生成、肌肉和骨骼肌代謝中具有重要作用。近年來(lái)，雄激素對(duì)心血管系統(tǒng)的影響備受關(guān)注，但它與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系尚不明確。動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及泡沫細(xì)胞的形成是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往的研究揭示，生理濃度的二氫睪酮可以抑制巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及泡沫細(xì)胞的形成，提示雄激素在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中也可能發(fā)揮很重要的作用［1］。

雄激素必須與雄激素受體（androgen receptor，AR）結(jié)合才能發(fā)揮生理作用。AR是配體依賴的甾體類核受體超家族成員，與其他核受體的結(jié)構(gòu)類似，包括3個(gè)主要的功能域：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的N?端結(jié)構(gòu)域（N?terminal domain，NTD）、DNA結(jié)合域（DNA?binding domain，DBD）、C?端配體結(jié)合域（ligand?bind?ing domain，LBD）。其中，DBD通過(guò)1個(gè)較短的鉸鏈區(qū)與LBD相連，鉸鏈區(qū)包含1個(gè)核定位信號(hào)（nucle?ar localization signal，NLS），在配體（雄激素）存在的情況下，能幫助AR進(jìn)入核內(nèi)，與DNA特定部位結(jié)合，從而介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［2?3］。LBD區(qū)的配體依賴（ligand?dependent）的激活功能區(qū)2（AF2）是AR中已經(jīng)明確的2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)之一。因此，研究AR?LBD區(qū)的作用及與其相互作用的蛋白，可能對(duì)揭示雄激素在動(dòng)脈粥樣硬化及其他激素相關(guān)疾病中的作用有重要的意義。

本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)從男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)篩選與AR?LBD相互作用的蛋白，并進(jìn)一步通過(guò)Pull?down實(shí)驗(yàn)及免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證了二者在體外的相互作用。

1　材料與方法

1.1材料

男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)，酵母菌株AH109；CloneMinerⅡcDNA Library構(gòu)建試劑盒，F(xiàn)astTrack MAG mRNA純化試劑盒，Platinum Taq DNA聚合酶，Super ScriptⅢFirst?Strand合成系統(tǒng)，PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo試劑盒，PureLinkTMHQ Mini Plasmid DNA純化試劑盒，Lipofectamine 2000，In?FusionTMAdvantage PCR Clon?ing Kit均購(gòu)自美國(guó)Thermofisher Scientific公司；第三代Matchmaker Ga14雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker Ga14 yeast two hybridsystem 3）及pGEX4T2、pEGFP?C1、pDsRed?C1購(gòu)自日本Clontech公司；BD克隆質(zhì)粒pGBKT7，AD克隆質(zhì)粒pGADT7，MagneGSTTMPull?down System試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。KOD?Plus?Neo聚合酶購(gòu)自日本TOYOBO公司。所需的限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司。酸洗玻璃珠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。引物合成及測(cè)序由中國(guó)上海Invitrogen公司完成。

1.2方法

1.2.1男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：應(yīng)用Clone?MinerⅡcDNA構(gòu)建試劑盒，對(duì)健康男性外周血分離的2.5×107單核細(xì)胞進(jìn)行mRNA分離，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后連接3種不同讀框的adaptor，通過(guò)BP重組方法分別克隆進(jìn)pDONR222載體，制備成1個(gè)初級(jí)cDNA文庫(kù)。提取pDONR222混合質(zhì)粒，通過(guò)LR重組到酵母雙雜交載體pGADT7?DEST上，制備成酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提。

1.2.2構(gòu)建pGBKT7?LBD重組質(zhì)粒：以AR DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得AR配體結(jié)合域（AR?LBD）基因片段，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增AR?LBD全序列的特異性引物：Forward，5′?CATGGAGGCCGAATCCTATGAA TGTCAGCCCATCTTTCTG?3′；Reverse，5′?GCAGGTC GACGGATCCTCACTGGGTGTGGAAATAGATGGG?3′。

1.2.3酵母雙雜交篩選：將AR?LBD基因片段構(gòu)建到含轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)合域的載體中（pGBKT7?AR?LBD），將其作為誘餌，對(duì)構(gòu)建在含轉(zhuǎn)錄激活域的酵母表達(dá)載體上的男性單核巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4Pull?down實(shí)驗(yàn)：將PGADT7?TPM3建成含有GST標(biāo)簽的pGEX?TPM3。將AR?LBD序列克隆到含有c?Myc標(biāo)簽的pCDNA3.1載體上，按照Magne GSTTMPull?down System說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，利用West?ern blotting技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)：采用SalⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，通過(guò)酶切方法構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP?AR?LBD及pDsRed?TPM3。AR?LBD引物為Forward，5′?GAATTCT GCAGTCGACTATGAATGTCAGCCCATCTTTCTG?3′；Reverse，5′?CTAGATCCGGTGGATCCTCACTGGGT GTGGAAATAGATGGG?3′。原肌球蛋白3（tropomyo?sin，TMP3）引物序列Forward，5′?GAATTCTGCAGTC?GACATGGCTGGGATCACCACCATCGAG?3′；Re?verse，5′?CTAGATCCGGTGGATCCCTACATCTCATT CAGGTCAAGCAG?3′。將pEGFP?AR?LBD和pD?sRed?TPM3共轉(zhuǎn)染入293HEK細(xì)胞中，利用免疫熒光觀察2種蛋白共表達(dá)情況。

本研究通過(guò)盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為2014PS88K。

2　結(jié)果

利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在酵母細(xì)胞AH109中，用pGBKT7?AR?LBD從男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出相互作用的蛋白TPM3。

將文庫(kù)質(zhì)粒PGADT7?TPM3用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后克隆到含有GST標(biāo)簽的pGEX?4T?2載體上，將重組質(zhì)粒pGEX?TPM3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10中，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，TPM3融合蛋白成功表達(dá)。Pull?down實(shí)驗(yàn)及Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種蛋白在體外發(fā)生直接的相互作用（圖1）。

將pEGFP?AR?LBD和pDsRed?TPM3重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293HEK細(xì)胞中，通過(guò)共聚焦顯微鏡，觀察到pEGFP?AR?LBD融合蛋白與pDsRed?TPM3融合蛋白在胞質(zhì)中重疊共表達(dá)（圖2）。

3　討論

本研究應(yīng)用酵母雙雜交方法從男性單核細(xì)胞cDNA文庫(kù)中首次篩選出TPM3與AR?LBD存在相互作用，在體外通過(guò)Pull?down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TPM3與AR?LBD的相互作用，通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)免疫熒光進(jìn)一步確認(rèn)TPM3與AR?LBD在293 HEK細(xì)胞中重疊共表達(dá)。

原肌球蛋白是細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，是由2條平行的多肽鏈組成的α螺旋構(gòu)型二聚體。每條原肌球蛋白首尾相接形成1條連續(xù)鏈與肌動(dòng)蛋白細(xì)肌絲結(jié)合，正好位于雙螺旋微絲大溝中。在肌肉細(xì)胞，它們通過(guò)控制肌球蛋白頭端結(jié)合到肌動(dòng)蛋白絲調(diào)節(jié)肌肉收縮；在非肌肉細(xì)胞，原肌球蛋白在“細(xì)胞骨架”構(gòu)成中起重要作用。原肌球蛋白在細(xì)胞移動(dòng)、形態(tài)發(fā)生變化和胞質(zhì)移動(dòng)中可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化，因而對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲、免疫細(xì)胞歸巢、傷口愈合和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有重要作用［4］。

圖2　免疫熒光重疊共表達(dá)檢測(cè)Fig.2　Immunofluorescent co?localization test

人類有4個(gè)編碼原肌球蛋白的基因：Tropomyo? sin1（TPM1）、Tropomyosin2（TPM2）、Tropomyosin3（TPM3）和Tropomyosin4（TPM4）。TPM3基因編碼原肌球蛋白α?3鏈（tropomyosin alpha?3 chain），作為原肌球蛋白家族中的一員，與橫紋肌和平滑肌收縮系統(tǒng)中的肌動(dòng)蛋白或非肌肉細(xì)胞中的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相結(jié)合。

近年來(lái)，在腫瘤相關(guān)研究［5］中發(fā)現(xiàn)，TPM3的表達(dá)異常與腫瘤的惡性程度及死亡率有關(guān)。Tm5NM1為T(mén)PM3的低分子量亞型，是非肌肉組織中的原肌球蛋白，在細(xì)胞骨架的原肌球蛋白在細(xì)胞遷移中的作用方面，迄今為止研究最多。研究［6］表明，Tm5NM1在細(xì)胞遷移、細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)中決定細(xì)胞形態(tài)、張力纖維的形成和局部黏附作用，Tm5NM1過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致張力纖維數(shù)目增加，伸展能力增強(qiáng)，細(xì)胞移動(dòng)速度降低。應(yīng)用蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)人單核細(xì)胞系THP?1用oxLDL刺激后TPM3表達(dá)明顯升高，提示TPM3可能在oxLDL參與動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中也發(fā)揮作用。RAMAIOLA等［7］通過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療研究了急性心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓成分的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)隨著從心肌梗死發(fā)病到介入治療間的時(shí)間不同，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白組（如β肌動(dòng)蛋白、TPM3和TPM4）在3 h以內(nèi)組和6 h以上組有明顯差異，3 h以內(nèi)組的冠狀動(dòng)脈血栓主要由血小板和纖維蛋白原組成，而6 h以上組的血栓中血小板成分減少，單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞成分增多，提示TPM3和TPM4可能與血栓中炎性細(xì)胞的遷移和黏附有關(guān)。

既往的研究［8］表明，生理濃度的二氫睪酮可以抑制單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及泡沫細(xì)胞的形成，AR參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的募集及浸潤(rùn)。單核巨噬細(xì)胞的遷移和募集在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中也起著非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了TPM3與AR?LBD存在明確的相互作用，基于TPM3為關(guān)鍵的細(xì)胞骨架蛋白，提示雄激素可能通過(guò)AR?LBD及與之相互作用的TPM3影響單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，從而在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用。本研究為闡明AR參與調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的募集及浸潤(rùn)的機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。TPM3可能成為防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要靶點(diǎn)。而TPM3與AR?LBD在體內(nèi)的作用有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

［1］QIU Y，YANASE T，HU HD，et al.Dihydrotestosterone suppresses foam cell formation and attenuates atherosclerosis development［J］. Endocrinology，2010，151（7）：3307-3316.DOI：10.1210/en.2009?1268.

［2］HELSEN C，DUBOIS V，VERFAILLIE A，et al.Evidence for DNA?binding domain??ligand?binding domain communications in the an? drogen receptor［J］.Mol Cell Biol，2012，32（15）：3033-3043. DOI：10.1128/MCB.00151?12.

［3］WILSON EM.Analysis of interdomain interactions of the androgen receptor［J］.Methods Mol Biol，2011，776：113-129.DOI：10.1007/ 978?1?61779?243?4_8.

［4］LEES JG，BACH CT，O’NEILL GM，et al.Interior decoration：tropo?myosin in actin dynamics and cell migration［J］.Cell Adh Migr，2011，5（2）：181-186.

［5］TAO T，SHI Y，HAN D，et al.TPM3，a strong prognosis predictor，is involved in malignant progression through MMP family members and EMT?like activators in gliomas［J］.Tumour Biol，2014，35（9）：9053-9059.DOI：10.1007/s13277?014?1974?1.

［6］BACH CT，CREED S，ZHONG J，et al.Tropomyosin isoform expres?sion regulates the transition of adhesions to determine cell speed and direction［J］.Mol Cell Biol，2009，29（6）：1506-1514.DOI：10.1128/MCB.00857?08.

［7］RAMAIOLA I，PADRO T，PENA E，et al.Changes in thrombus com?position and profilin?1 release in acute myocardial infarction［J］. Eur Heart J，2015，36（16）：965-975.DOI：10.1093/eurheartj/ ehu356.

［8］IZUMI K，MIZOKAMI A，LIN WJ，et al.Androgen receptor roles in the development of benign prostate hyperplasia［J］.Am J Pathol，2013，182（6）：1942-1949.DOI：10.1016/j.ajpath.2013.02.028.

（編輯王又冬）

Interaction of Tropomyosin Alpha?3 Chain with the Ligand?binding Domain of the Androgen Receptor

QIU Yang1，CHEN Xiaoya1，SUN Zhengrong2，HU Bingqing1，XU Pinyi1，CUI Lei1，LI Ling1
（1.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Viral Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the possible role and mechanisms of the androgen receptor（AR）in atherosclerosis，we screened the protein that interacted with the AR ligand?binding domain（LBD）.MethodsA yeast two?hybrid system was adopted using the LBD as bait to find the new proteins，which may interact with the AR?LBD in a cDNA library of male peripheral blood monocyte.Then this interaction was further verified by Pull?down and co?localization experiment by immunofluorescence.ResultsWe found a novel protein tropomyosin alpha?3 chain which inter?acted with the LBD of the AR.The interaction of the AR?LBD with tropomyosin alpha?3 chain was confirmed by a glutathione S?transferase（GST）pull?down assay.Furthermore，co?localization experiments by fluorescent confocal microscopy revealed that the AR?LBD co?localized with tropomy?osin alpha?3 chain in 293HEK cells.ConclusionAn interaction between the AR?LBD and tropomyosin alpha?3 chain in male peripheral blood monocyte may provide insights into the role and mechanisms of the signaling pathway of the androgen?AR in atherosclerosis.

androgen receptor；tropomyosin alpha?3 chain；monocyte；yeast two?hybrid screen；atherosclerosis

R543.5

A

0258-4646（2016）11-0973-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81170779）

邱陽(yáng)（1970-），女，副教授，博士. E-mail：qy_sunny@hotmail.com

2016-01-18

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