岑令平，梁嘉健，張銘志

巨噬細(xì)胞刺激因子（MSF）與巨噬細(xì)胞抑制因子（MIF）對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞軸突再生的影響

岑令平，梁嘉健，張銘志

目的研究巨噬細(xì)胞刺激因子（macrophage stimulating factor，MSF）及巨噬細(xì)胞抑制因子（macrophage inhibitory factor，MIF）對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）軸突再生的影響。方法實(shí)驗(yàn)性研究。費(fèi)希爾大鼠9只，施行視神經(jīng)損傷術(shù)7 d后取出眼球并剝離視網(wǎng)膜，把剝離下來(lái)的視網(wǎng)膜平鋪，放射狀剪成8片，每一片視網(wǎng)膜粘鋪于已包被好的培養(yǎng)板孔中，分為對(duì)照組、MSF組、MIF組，分別加入培養(yǎng)基及MSF/MIF等處理因素試劑；培養(yǎng)7 d后對(duì)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊進(jìn)行固定及免疫熒光染色，分別計(jì)數(shù)RGC再生神經(jīng)軸突的數(shù)量及長(zhǎng)度和外遷巨噬細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果與對(duì)照組相比，MSF及MIF可以一定程度上分別增多及減少遷移巨噬細(xì)胞的數(shù)量（P＞0.05），與此同時(shí)，MIF可以減少RGC再生神經(jīng)軸突的數(shù)量及長(zhǎng)度（P＜0.05），MSF雖未能增加神經(jīng)突的長(zhǎng)度，但還是有效地增加了再生神經(jīng)突的數(shù)量（P＜0.05）。結(jié)論MSF可以促進(jìn)RGC神經(jīng)軸突的再生，與此相反MIF可以抑制神經(jīng)軸突的再生。

視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；視神經(jīng)損傷；存活；神經(jīng)再生

視神經(jīng)損傷嚴(yán)重影響視覺(jué)功能，甚至可以導(dǎo)致視力喪失而致盲。視神經(jīng)損傷會(huì)引起大量視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）繼發(fā)性凋亡，從而導(dǎo)致視力損害。研究表明，在大鼠視神經(jīng)被橫切3周后，只有約10%的RGC能存活下來(lái)〔1〕。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，在損傷后缺乏再生的能力，而且中樞神經(jīng)膠質(zhì)存在很多阻礙神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的抑制因子，迄今仍缺乏有效的治療手段。目前大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在適當(dāng)?shù)臈l件下，中樞神經(jīng)纖維也可以再生，促進(jìn)再生的方法包括應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔2〕、雪旺氏細(xì)胞移植、外周神經(jīng)移植、下調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子等〔3〕。

近年的研究顯示，通過(guò)往眼內(nèi)注入巨噬細(xì)胞激活劑酵母聚糖（zymosan，ZYM）來(lái)激活巨噬細(xì)胞同樣可以顯著地促進(jìn)RGC的存活及神經(jīng)軸突再生〔4〕，而應(yīng)用巨噬細(xì)胞抑制因子（macrophage inhibitory factor，MIF）或巨噬細(xì)胞清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體可以明顯降低其促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用〔5〕。然而，眼內(nèi)注射ZYM除了可以趨化并激活來(lái)自外周血的巨噬細(xì)胞外，還有可能激活視網(wǎng)膜組織當(dāng)中的巨噬細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞〔6〕，并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)作用，但這些作用是否有利于神經(jīng)修復(fù)尚未被完全闡明。我們前期的研究工作表明，視神經(jīng)損傷本身可以激活視網(wǎng)膜的小膠質(zhì)細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞，以清除凋亡的RGC〔7〕。有研究顯示，巨噬細(xì)胞刺激因子（macrophage stimulating factor，MSF）及MIF可以直接影響巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，從而影響實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的轉(zhuǎn)歸〔8〕。本研究擬應(yīng)用體外視網(wǎng)膜整體培養(yǎng)模型，研究MSF/MIF對(duì)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，并觀察其對(duì)培養(yǎng)視網(wǎng)膜中神經(jīng)軸突再生的直接影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

8～10周齡費(fèi)希爾大鼠9只，體質(zhì)量約200 g（北京維通利華公司）；生物安全柜（上海瑞仰凈化裝備公司）；手術(shù)顯微鏡（德國(guó)LEICA）；眼科手術(shù)器械（蘇州六六公司）；培養(yǎng)板（美國(guó)Corning）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)REVCO）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）；圖像采集分析系統(tǒng)（美國(guó)Conpix）。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基Neurobasal-A、B27及谷氨酰胺（美國(guó)Invitrogen）；視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞特異性抗體TUJ-1（美國(guó)COVANCE）；巨噬細(xì)胞特異性抗體ED-1（美國(guó)Serotec）；Cy3熒光染料（美國(guó)Jackson Lab）；MSF（美國(guó)Sigma-Aldrich）；MIF（美國(guó)Sigma-Aldrich）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1視神經(jīng)損傷模型：研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷本身可以刺激培養(yǎng)中RGC神經(jīng)軸突的再生，因此在視網(wǎng)膜整體培養(yǎng)之前7 d，我們對(duì)視神經(jīng)進(jìn)行損傷處理〔9〕。具體操作如下：腹腔注射1.5 ml/kg 1：1混合的鹽酸氯胺酮（100 mg/ml）及鹽酸賽拉嗪（20 mg/ml）麻醉大鼠。在左側(cè)眼球上方切開(kāi)結(jié)膜切口長(zhǎng)約5 mm，分離眼外肌及眶內(nèi)結(jié)締組織暴露視神經(jīng)。在距離眼球后端1.5 mm處用顯微眼科鑷夾緊視神經(jīng)持續(xù)10 s，以達(dá)到完全離斷視神經(jīng)而確保視神經(jīng)外鞘膜完整性，操作中注意避免傷及行走在視神經(jīng)下的血管〔5〕，損傷術(shù)后大鼠存活7 d。

1.2.2包被培養(yǎng)板：視網(wǎng)膜培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，培養(yǎng)板需進(jìn)行預(yù)先包被，每孔加入0.25 ml多聚賴氨酸（200 μg/ml溶于超純水）在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜。超純水洗5 min×3次，加入層粘連蛋白[20 μg/ml溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）]置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中2 h，進(jìn)行視網(wǎng)膜培養(yǎng)前用PBS洗3次。

1.2.3視網(wǎng)膜分組培養(yǎng)：9只大鼠在視神經(jīng)損傷術(shù)后7 d進(jìn)行過(guò)量麻醉處死，無(wú)菌操作下取出眼球，置于冰冷的平衡鹽溶液中進(jìn)行視網(wǎng)膜剝離，把剝離下來(lái)的視網(wǎng)膜平鋪，放射狀剪成8片，取其中的3片隨機(jī)分配至對(duì)照組、MSF及MIF處理組，即每組培養(yǎng)9個(gè)視網(wǎng)膜塊，每組里面的各個(gè)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊均取自不同個(gè)體大鼠左側(cè)眼球的視網(wǎng)膜。將每一片視網(wǎng)膜粘鋪于已包被好的培養(yǎng)板孔中，對(duì)照組加入0.5 ml培養(yǎng)基（Neurobasal-A+B27+谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素），MSF、MIF組除培養(yǎng)基外分別加入MSF（終濃度為1 μmol/L）及MIF（終濃度為5 μmol/L），均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d〔5〕。

1.2.4免疫組織化染色觀察再生神經(jīng)軸突及遷移巨噬細(xì)胞：培養(yǎng)7 d后，用4%多聚甲醛（上海生工公司）固定視網(wǎng)膜2 h，然后用PBS洗5 min×3次，加10%正常羊血清封閉液，濕盒內(nèi)室溫封閉1 h，吸掉多余液體，加入視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞特異性抗體TUJ-1或巨噬細(xì)胞特異性抗體ED-1，濕盒內(nèi)常溫1 h，PBS洗5 min×3次，加入熒光二抗Cy3，濕盒內(nèi)常溫1 h，PBS洗5 min×3次后在倒置熒光顯微鏡下觀察再生神經(jīng)軸突或遷移的巨噬細(xì)胞，并對(duì)每個(gè)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊再生軸突的數(shù)量與長(zhǎng)度及外遷巨噬細(xì)胞的數(shù)量分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。再生軸突的數(shù)量為從每個(gè)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊長(zhǎng)出的所有神經(jīng)軸突的數(shù)量；把每個(gè)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊再生最長(zhǎng)的5根軸突長(zhǎng)度的平均值記錄為再生軸突的長(zhǎng)度〔5〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad InStat（V2.04）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法〔10-11〕。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1MSF/MIF對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響

往視網(wǎng)膜外遷移的巨噬細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量分別為圖1A、1B、1C所示。巨噬細(xì)胞在視網(wǎng)膜培養(yǎng)第3～4天開(kāi)始從視網(wǎng)膜塊里往外遷移，并日漸增加，培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組平均每個(gè)視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊往外遷移的巨噬細(xì)胞數(shù)量為306±34。當(dāng)培養(yǎng)基中加入巨噬細(xì)胞激活劑MSF后，往外遷移的巨噬細(xì)胞平均數(shù)量約增多了30%（402±43），而應(yīng)用巨噬細(xì)胞抑制劑MIF后，外遷的巨噬細(xì)胞數(shù)量則明顯下降了30%（208±35）。MSF或MIF處理后，雖然遷移的細(xì)胞平均數(shù)量有所改變，但由于變異性較大，與對(duì)照組相比差別并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；然而MSF與MIF組間的差異則非常明顯（P＜0.01）（表1）。

2.2MSF/MIF對(duì)RGC神經(jīng)軸突再生的影響

從視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊長(zhǎng)出的RGC神經(jīng)軸突形態(tài)及數(shù)量分別為圖1D、1E、1F所示。在視網(wǎng)膜培養(yǎng)第2天開(kāi)始即可見(jiàn)少量神經(jīng)軸突從視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊邊緣生長(zhǎng)出來(lái)，并沿培養(yǎng)板表面向外延伸，神經(jīng)突的數(shù)量及長(zhǎng)度日漸增加。視網(wǎng)膜培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊的平均再生神經(jīng)軸突數(shù)量為23±2.8，長(zhǎng)度為（1.31±0.12）mm。MSF在促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移的同時(shí)也明顯促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，使其數(shù)量增加50%（36±3.3）（P＜0.05），但神經(jīng)軸突的長(zhǎng)度并未明顯受影響[（1.53±0.09）mm]。MIF則可以明顯抑制神經(jīng)軸突的再生，與對(duì)照組比較，它既可以減少再生神經(jīng)軸突的數(shù)量（12±2.7）（P＜0.05），同時(shí)也使再生神經(jīng)軸突的長(zhǎng)度降低了40%[（0.82±0.11）mm）]（P＜0.05）（表1）。

表1　各組大鼠視網(wǎng)膜培養(yǎng)7 d后巨噬細(xì)胞遷移及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生指標(biāo)比較（）

表1　各組大鼠視網(wǎng)膜培養(yǎng)7 d后巨噬細(xì)胞遷移及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生指標(biāo)比較（）

注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觯嘀乇容^采用Bonferroni法。與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與MSF組比較，②P＜0.01，③P＜0.001 MSF：巨噬細(xì)胞刺激因子MIF：巨噬細(xì)胞抑制因子

再生軸突長(zhǎng)度（m m）對(duì)照組9 3 0 6 ± 3 4 2 3 ± 2 . 8 1 . 3 1 ± 0 . 1 2 M S F組9 4 0 2 ± 4 3 3 6 ± 3 . 3①1 . 5 3 ± 0 . 0 9 M I F組9 2 0 8 ± 3 5②1 2 ± 2 . 7①③0 . 8 2 ± 0 . 1 1①③F值6 . 6 7 1 6 . 6 4 1 1 . 4 5 P值0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 1 0 . 0 0 0 3組別培養(yǎng)塊個(gè)數(shù)巨噬細(xì)胞數(shù)量再生軸突數(shù)量

圖1　各組大鼠視網(wǎng)膜培養(yǎng)7 d后倒置熒光顯微鏡像（Cy3×200）。顯示視網(wǎng)膜培養(yǎng)中外遷的巨噬細(xì)胞及再生的神經(jīng)軸突纖維。對(duì)照組可見(jiàn)巨噬細(xì)胞（A）及神經(jīng)軸突（D）從視網(wǎng)膜培養(yǎng)塊（*）邊緣外遷及生長(zhǎng)出來(lái)，并向外延伸；MSF組可見(jiàn)外遷巨噬細(xì)胞（B）及再生神經(jīng)軸突（E）明顯增多；MIF組可見(jiàn)外遷巨噬細(xì)胞（C）及再生神經(jīng)軸突（F）顯著減少M(fèi)SF：巨噬細(xì)胞刺激因子MIF：巨噬細(xì)胞抑制因子

3　討論

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）除了能夠促進(jìn)RGC的存活及軸突再生〔11〕，也可以導(dǎo)致眼內(nèi)巨噬細(xì)胞的增加，并證明趨化到眼內(nèi)的巨噬細(xì)胞也參與CNTF的促神經(jīng)修復(fù)作用〔5〕，其它研究也證實(shí)眼內(nèi)巨噬細(xì)胞的直接激活可以有效地促進(jìn)RGC存活及神經(jīng)軸突再生〔4〕。被激活的巨噬細(xì)胞既可以分泌多種促神經(jīng)修復(fù)的因子，其中包括主要促進(jìn)神經(jīng)元存活的因子如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔12〕，也包括主要促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的因子，如癌調(diào)蛋白〔13〕。可見(jiàn)，巨噬細(xì)胞激活具有促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)的作用。一般認(rèn)為，眼內(nèi)被激活的巨噬細(xì)胞是來(lái)自外周血液循環(huán)的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)〔12〕，但有研究者認(rèn)為視網(wǎng)膜內(nèi)處于靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞也可以被激活為具有吞噬功能及分泌功能的活性巨噬細(xì)胞〔14〕，這些細(xì)胞被激活后也可以分泌各種細(xì)胞因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔15-16〕，但神經(jīng)組織來(lái)源的巨噬細(xì)胞是否具有促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)的作用并沒(méi)有被研究清楚。本研究通過(guò)應(yīng)用MSF及MIF對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織直接作用來(lái)研究其對(duì)視網(wǎng)膜組織自身的巨噬細(xì)胞及RGC神經(jīng)軸突的再生的影響。MSF又稱Tuftsin〔17〕，結(jié)構(gòu)為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸，能夠激活巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其自然殺傷及抗腫瘤的作用〔18〕；巨噬細(xì)胞抑制因子MIF在結(jié)構(gòu)上比MSF少一個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸，常用于抑制巨噬細(xì)胞的活性〔19〕。在體外視網(wǎng)膜培養(yǎng)模型中，由于缺乏外周血循環(huán)來(lái)源的巨噬細(xì)胞，我們可以觀察到MSF及MIF對(duì)視網(wǎng)膜來(lái)源的巨噬細(xì)胞的直接作用，結(jié)果顯示向培養(yǎng)塊外遷移的巨噬細(xì)胞會(huì)分別相應(yīng)地增多及減少；與此同時(shí)，MIF還可以減少RGC再生神經(jīng)突的數(shù)量及長(zhǎng)度，MSF雖未能增加神經(jīng)突的長(zhǎng)度，但還是有效地增加了再生神經(jīng)突的數(shù)量。由此可見(jiàn)，視網(wǎng)膜來(lái)源的巨噬細(xì)胞被MSF激活后，很可能產(chǎn)生一些有利于神經(jīng)軸突再生的因子，但是否會(huì)像血液源性的巨噬細(xì)胞一樣，產(chǎn)生可以強(qiáng)烈促進(jìn)軸突再生的癌調(diào)蛋白仍需進(jìn)一步研究。

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Effects of macrophage stimulating factor and macrophage inhibitory factor on retinal ganglion cell ax-on regeneration in retinal explant

CEN Lingping，LIANG Jiajian，ZHANG Mingzhi.
Joint Shantou International Eye Center of Shantou University and The Chinese University of Hong Kong，Shantou 515041，Guangdong，China

OBJECTIVE To investigate the effects of macrophage stimulating factor（MSF）and macrophage inhibitory factor（MIF）on retinal ganglion cells（RGC）axon regeneration in retinal explant.METHODS It was an experimental study.Seven days after optic nerve（ON）transection of Fischer rat，retinas were extracted out and flat-mounted onto a filter paper.After being cut into 8 pieces，each piece of retina was glued to the substrate of culture plate and incubated in culture medium with MSF or MIF interventions respectively.Retinal explants were fixed after cultured for seven days.After fluorescent immunostaining，migrating out macrophages and regenerating axon were counted under the fluorescent microscope.Main outcome were number of migrating out macrophage，number and length of regenerating axons.RESULTS Compared with the control group，MSF and MIF could increase or decrease the number of migrating out macrophages respectively.Meanwhile，MIF could increase the number of regenerating axons and their length.However，MSF could only increase the number of regenerating axons，but had no effect on axon length.CONCLUSIONS The MSF could promote axon regeneration in retinal explant，while MIF could inhibit axon regeneration.

retinal ganglion cell;macrophage;injury of optic nerve;subsist;axon regeneration

R774

A

1002-4379（2016）03-0150-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.003

國(guó)家自然科學(xué)研究基金（81570849）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20114402120007）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313446）

汕頭大學(xué)·香港中文大學(xué)聯(lián)合汕頭國(guó)際眼科中心，廣東汕頭515041

岑令平，E-mail：cenlp@hotmail.com