易 勇 唐 旭 林錫煌 劉源森 林 凌 徐長(zhǎng)安*

1(國(guó)家海洋局第三海洋研究所, 廈門 361005) 2(福建農(nóng)林大學(xué)食品學(xué)院, 福州 350002)

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超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定馬尾藻中4種內(nèi)源性植物激素

易 勇1,2唐 旭1林錫煌1劉源森1林 凌1徐長(zhǎng)安*1

1(國(guó)家海洋局第三海洋研究所, 廈門 361005)2(福建農(nóng)林大學(xué)食品學(xué)院, 福州 350002)

建立了利用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定馬尾藻中4種植物激素(吲哚乙酸、吲哚丁酸、脫落酸、玉米素)的方法。馬尾藻樣品經(jīng)過70%甲醇提取后，經(jīng)PCX+PAX固相小柱凈化，使用反相C18色譜柱分離。以5 mmol/L乙酸銨(含0.01%甲酸)和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)分析測(cè)定。在0.01～1.0 μg/mL內(nèi)，各種植物激素的相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。4種植物激素的回收率為84.3%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～6.4%。本方法的檢出限為0.025～0.2 μg/kg。

馬尾藻; 雙柱聯(lián)用; 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 內(nèi)源性植物激素

1 引 言

海藻是海洋資源的重要組成部分，是一種低等隱花植物，有綠藻、褐藻、紅藻、藍(lán)藻等10門。研究發(fā)現(xiàn)，海藻中含有許多活性物質(zhì)，可以開發(fā)成海洋醫(yī)藥、保健、化妝用品等[1]。馬尾藻是一類褐藻(Phaeophyta)，作為海藻中的大型經(jīng)濟(jì)海藻，其種類超過250種，廣泛分布于暖水和溫暖的海域。我國(guó)的廣東和廣西沿海盛產(chǎn)馬尾藻，約有60種[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，海藻中的促生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)陸生植物具有顯著的促生長(zhǎng)作用[3]，已有一些基于海藻植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的商業(yè)產(chǎn)品出現(xiàn)[4]。我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，隨著海藻生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的商業(yè)化進(jìn)程，對(duì)于馬尾藻植物激素的檢測(cè)方法的開發(fā)顯得十分的必要。

海藻植物激素是一類十分重要的內(nèi)源植物激素，含有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、脫落酸(ABA)及玉米素(ZT)等植物激素[5,6]。目前,對(duì)于海藻中植物激素的研究報(bào)道很少，并且國(guó)內(nèi)未建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，多組分植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也尚未建立。因此選擇合適的檢測(cè)方法對(duì)于海藻植物激素的檢測(cè)顯得更加重要。目前，關(guān)于植物激素的檢測(cè)方法主要有三大類，分別是生物測(cè)試、免疫檢測(cè)和儀器分析方法。其中，儀器分析方法具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢(shì)，特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，是近年來(lái)生物化學(xué)中常用的檢測(cè)技術(shù)[7～9]。

目前，還未見雙柱聯(lián)用凈化方法用于馬尾藻植物激素檢測(cè)的報(bào)道，關(guān)于固相萃取文獻(xiàn)中的方法大多數(shù)只能檢測(cè)同一類性質(zhì)的植物激素[10]。鐘冬蓮等[11]采用HPLC-MS/MS法成功測(cè)定了毛竹筍4種典型的內(nèi)源性植物激素。本研究采用固相萃取雙柱聯(lián)用凈化的方法，可以同時(shí)檢測(cè)多組分不同性質(zhì)的植物激素，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。此外本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)海藻中的4種植物激素同時(shí)進(jìn)行分析檢測(cè),并探究了檢測(cè)條件、前處理技術(shù)和方法學(xué)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Acquity超高效液相色譜儀(二極管列陣檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司); Extrapid柱-盤手動(dòng)固相萃取儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司); QTrap5500線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司); Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司); 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司); Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司); KQ-300E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); BAS124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國(guó)BUCHI公司); 津騰溶劑過濾器(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); IKA-Tisbasi組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司); 固相小柱PAX和PCX(月旭材料科技(上海)有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:吲哚乙酸、吲哚丁酸、玉米素、脫落酸 (美國(guó)Sigma公司); 甲醇(色譜純，美國(guó)Spectrum公司); 甲酸(色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所); 乙酸銨(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑股份有限公司); 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT 生工生物工程(上海)股份有限公司); 氨水(分析純，西隴化工股份有限公司); 水為Milli-Q超純水; 緩沖溶液(含0.1%甲酸、0.5 mmol/L乙酸銨，pH 3.1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取10 mg(精確到0.01 mg)的IAA, IBA, ABA和ZT標(biāo)準(zhǔn)品，用100% 甲醇定容到100 mL，配制100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，密封, 于-20℃儲(chǔ)存。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL 于10 mL容量瓶中，用液相體系(60%緩沖溶液和40%甲醇,V/V)定容，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)一步稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

2.3 樣品制備

2.3.1 樣品前處理 馬尾藻四月下旬采集于東山島，潔凈海水漂洗多次，用吸水紙將表面吸干，-20℃保存。參考QuEChERS(Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe)快速前處理方法的稱樣量[12]，準(zhǔn)確稱取10 g鮮海藻樣品(精確至0.01 g)，剪切破碎后，用勻漿機(jī)勻漿，加入30 mL 70% 甲醇溶液和5 mg抗氧化劑BHT，置于超聲波中提取15 min。再將提取液于8000 r/min條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL燒杯中。將上清液于0.04 MPa、100 r/min、35℃條件下減壓濃縮至1 mL。

2.3.2 樣品凈化

分別用2 mL 100% 甲醇活化和2 mL 0.05% 甲酸溶液平衡固相萃取小柱PCX，然后將前處理好的1 mL濃縮液上樣，收集流出液; 再用2 mL 10% 甲醇溶液淋洗，收集淋洗液，最后用2 mL氨水-甲醇溶液(5∶95，V/V)洗脫，收集洗脫液。將淋洗液和流出液合并，上樣于2 mL 100% 甲醇活化和2 mL 0.1% 甲酸平衡好的固相萃取小柱PAX，再用2 mL 10%甲醇溶液淋洗，最后用2 mL 甲酸-甲醇溶液(5∶95，V/V)洗脫，收集洗脫液。合并兩次洗脫液，于0.03 MPa、100 r/min、35℃條件下減壓濃縮至干。再準(zhǔn)確加入1.0 mL配制好的緩沖水溶液渦旋振蕩溶解殘留物，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，使用UPLC-MS/MS分析檢測(cè)。

2.4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件

2.4.1 超高效液相色譜條件 ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm; Waters公司); 柱溫：35℃; 樣品溫度：25℃; 進(jìn)樣體積： 5 μL; 流速：0.3 mL/min; 流動(dòng)相： 60% 緩沖溶液為流動(dòng)相A、40%甲醇為流動(dòng)相B; 洗脫程序：0～7 min，60%～20% A; 7～9 min，20%～60% A; 9～12 min，60% A。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI); 掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM); 采用正離子掃描模式; 電噴霧電壓(IS)：5500 V; 霧化氣電壓(GS1)：50 V; 碰撞氣壓力(CAD)：Mediun; 氣簾氣電壓(CUR)：30 V; 輔助氣電壓(GS2)：50 V; 離子源溫度(TEM)：500℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理提取溶劑的優(yōu)化

由于植物激素大多數(shù)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)物[13]，所以使用有機(jī)溶劑提取。本研究考察了不同濃度(100%, 90%, 70%和 50%)甲醇溶液的提取效果，為維持植物激素的穩(wěn)定性，溶液中添加抗氧化劑BHT。每組設(shè)3個(gè)平行，通過UPLC-MS/MS法分別測(cè)定4種內(nèi)源植物激素含量。

由表1可知，采用70%甲醇提取，得到的植物激素含量最高。由于植物激素吲哚乙酸在高溫甚至常溫下，時(shí)間過長(zhǎng)易于分解; 如果水系過多，濃縮時(shí)需要更多的時(shí)間，不利于植物激素的提取，因此70%甲醇提取植物激素吲哚乙酸提取量較低。如果有機(jī)溶劑含量過多，有機(jī)溶劑除了溶解植物激素外，還溶解了植物體中含有的許多其它的有機(jī)物，它們之間可能發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，不利于吲哚乙酸的穩(wěn)定，造成吲哚乙酸含量的減少，100%和90%甲醇提取吲哚乙酸含量較少可能與此有關(guān)。綜合考慮，本研究選擇70%甲醇進(jìn)行馬尾藻內(nèi)源性植物激素的提取。

表1 不同提取方式所得馬尾藻中4種植物激素的含量

Table 1 Plant hormone content with different extraction methods

激素種類Planthormone激素含量Planthormonecontent(ng/gFW)100%CH3OH90%CH3OH70%CH3OH50%CH3OH吲哚乙酸Indole-3-aceticacid,IAA5.675.8723.725.47脫落酸Abscisicacid,ABA0.440.480.570.51吲哚丁酸Indole-3-butyricacid,IBA1.241.521.261.28玉米素Zeatin,ZT1.721.751.791.74

3.2 凈化方法的優(yōu)化

提取海藻植物激素常采用甲醇作為溶劑，然而在經(jīng)多次萃取的離心后，會(huì)有大量色素、醌類和酚類等雜質(zhì)溶入提取液中，如果這些物質(zhì)不經(jīng)過凈化去除，就會(huì)對(duì)儀器的靈敏度和準(zhǔn)確度產(chǎn)生很大影響，同時(shí)也會(huì)縮短色譜柱使用壽命。為了最大程度降低雜質(zhì)的干擾，通常采用固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理[14]。在植物激素中，同時(shí)含有酸性和堿性植物激素，所以采用單純的陽(yáng)離子或者陰離子固相小柱凈化，都會(huì)使部分植物激素?fù)p失。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)如果單獨(dú)采用PAX固相小柱進(jìn)行處理，采用10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)試，會(huì)發(fā)生部分損失，這樣不利于植物激素的準(zhǔn)確檢測(cè)，其結(jié)果見圖1a。由于PAX固相小柱為陰離子固相小柱，對(duì)陽(yáng)離子(如H+)有吸附作用，對(duì)堿性的植物激素玉米素的吸附作用較差，其大部分作為流出液流出，檢測(cè)結(jié)果見圖1g，因此采用PCX+PAX雙柱聯(lián)用的方法。在優(yōu)化相關(guān)條件基礎(chǔ)上，雙柱聯(lián)用吸附效果較好(圖1c)。

圖1 4種植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)品(a)及其經(jīng)PAX固相小柱凈化(b), 經(jīng)PCX+PAX固相小柱凈化(c) 的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of the standard mixture (a), after purified by PAX solid-phase (b) and after purified by PCX and PAX solid-phase (c)色譜條件： ACQUITY UPLC CSH C18柱色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司); 柱溫： 35℃; 樣品溫度： 25℃; 進(jìn)樣體積： 10 μL; 流速： 0.15 mL/min; 波長(zhǎng)268 nm; 流動(dòng)相： 90%緩沖水溶液為流動(dòng)相A、 10%甲醇為流動(dòng)相B; 洗脫程序： 0～15 min，90%～10% A，15～18 min，10%～90% A，18～20 min，90% A。Conditions of (C): ACQUITY UPLC CSH C18 column (100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters Co.); column temperature: 35℃; sample temperature 25℃; injection volume: 10 μL; flow rate: 0.15 mL/min; wavelenth: 268 nm; mobile phase: 90% buffer solution as mobile phase A; 10% methanol as mobile phase B; Elution program: 0～15 min，90%～10% A; 15～18 min，10%～90% A; 18～20 min，90% A.

圖2 3種固相萃取方式的凈化回收率Fig.2 Recovery efficiencies for the three kinds of solid-phase extraction

固相萃取是植物激素研究常用的凈化方式，為了考察凈化效果和液相色譜柱上的保留行為，本研究考察了3種固相萃取方式，并以凈化回收率作為考察依據(jù)，如圖2所示，PCX+PAX的方式具有較好的回收率，回收率平均達(dá)到90%以上，而C18和HLB的回收率較差，平均不足50%，為了保證方法的凈化效果和準(zhǔn)確度，最終選擇PCX+PAX雙柱聯(lián)用的方式。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

相對(duì)于BEH C18色譜柱，本研究選用的CSH C18色譜柱可以提供更好的峰形和峰之間的分辨率，并且雜質(zhì)干擾較少[15]。

分別采用甲醇和乙腈作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈時(shí)，樣品出峰時(shí)間較早，當(dāng)4種植物激素組分同時(shí)進(jìn)樣時(shí)，采用乙腈流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰之間的分辨率低于甲醇流動(dòng)相的色譜標(biāo)準(zhǔn)品峰，因此采用甲醇作為洗脫流動(dòng)相。同時(shí)考察了不同初始流動(dòng)相比例，在初始流動(dòng)相中甲醇體積占85%和10%，色譜峰的結(jié)果分別如圖3所示,其它色譜條件見2.4.1節(jié)。

圖3 采用85%甲醇初始流動(dòng)相(a) 和10%甲醇初始流動(dòng)相(b)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solution with 85% methanol of mobile phase (a) and with 10% methanol of mobile phase (b)

較高比例(85%)的甲醇不利于4種植物激素色譜峰的分開?？赡苁怯捎跇O性不夠，不足以分開4種植物激素色譜峰。同時(shí)，當(dāng)甲醇比例降低時(shí)，出現(xiàn)峰形較差和溶劑效應(yīng)，在2 min左右出現(xiàn)溶劑峰。在本研究過程中發(fā)現(xiàn), 在流動(dòng)相的水系中添加少量乙酸銨可以增加離子化效率，進(jìn)而表現(xiàn)出較好的峰形和靈敏度。此外，為了保證本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性，同時(shí)維持水系酸度的穩(wěn)定，在流動(dòng)相的水系中再添加少量甲酸。圖4為添加乙酸銨和甲酸的4種植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰圖，檢測(cè)器為Qtrap5500質(zhì)譜檢測(cè)器，檢測(cè)條件見2.4.2節(jié)。

圖4 添加乙酸銨和甲酸后四種植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰圖Fig.4 Liquid chromatogram for the mixed standard solution of the four plant hormones with the addition of ammonium acetate and formate

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源(ESI)、正離子模式下，使用注射針泵，以20 μL/min的流速注入IAA、ABA、IBA和ZT標(biāo)準(zhǔn)品，在m/z100～300的掃描范圍內(nèi)分別對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行MS onLy質(zhì)譜掃描，確定IAA、ABA、IBA和ZT的分子離子，然后進(jìn)行Product MS2掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量CE(Collsion energy)確定合適的子離子(子離子質(zhì)譜圖如圖5)。最后進(jìn)行MRM模式掃描，分別對(duì)上述4種生長(zhǎng)素優(yōu)化CE 、去簇電壓DP(Declustering potential)等，使信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最佳響應(yīng)值(表2)。

3.5 方法評(píng)價(jià)

3.5.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限 取10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 配制成質(zhì)量濃度分別為0.01, 0.1, 0.25, 0.5和1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(以質(zhì)量濃度為X軸，對(duì)應(yīng)的峰面積為Y軸)。結(jié)果表明，在0.01～1.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，見表3。

結(jié)果表明，本方法對(duì)4種化合物檢出限較低，適于檢測(cè)馬尾藻內(nèi)源性植物激素含量。另外，馬尾藻通過凈化后，4種植物激素的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)均為負(fù)值，具有明顯的基質(zhì)減弱效應(yīng)，表明本方法中的前處理凈化方式的凈化效果明顯，適用于馬尾藻的基質(zhì)。

表2 4種植物激素的質(zhì)譜條件

Table 2 Mass spectrometry conditions for the four plant hormones

目標(biāo)分析物Analyte母離子Parention(m/z)子離子Daughterion(m/z)碰撞能量Collsionenergy(eV)去簇電壓Declusteringpotential(V)IAA176.0130.0*102.93543100IBA204.0130.1*144.1422195ABA265.1187.2*201.11917105ZT220.1136.0*118.9264890*定量離子(Quantitativeion)。

圖5 IAA(a), IBA(b), ABA(c)和 ZT(d)的子離子質(zhì)譜圖Fig.5 Mass chromatograms of IAA ion (a), IBA ion (b), ABA ion (c) and ZT ion (d)

表3 4種植物激素的線性方程及檢出限

Table 3 Linearity and detection limits of the four plant hormones

化合物Compound濃度范圍Rangeofconcentration(μg/mL)線性方程Calibrationequation回歸系數(shù)Regressioncoefficient(R2)基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)*Matrixeffectts(η,%)檢出限**Detectionlimit(μg/kg)IAA0.01～1y=9.51×106x+4.43×1040.9997-99.380.05IBA0.01～1y=4.84×106x-7.76×1030.9999-99.980.1ABA0.01～1y=3.51×107x+1.07×1050.9999-99.930.025ZT0.01～1y=1.12×108x-5.03×1040.9994-99.370.2*基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)表示為η=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)/溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;**按照信噪比S/N=3時(shí),采用本方法檢測(cè)出的植物激素的最低濃度即為檢出限。*Thematrixeffectisexpressedascoefficientη=(theslopeofmatrix-matchedstandardcurve-theslopeofthestandardcurvematc-hingsolvent)/theslopeofthestandardcurvematchingsolvent;**WhentheratioofsignalovernoiseS/N=3,thelowestconcen-trationofplanthormonesdetectedbythismethodisdefinedasthedetectionlimit.

表4 不同樣品激素的檢測(cè)含量、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

Table 4 Detected contents, recovery efficiencies and relative standard deviations for different hormone samples

樣品激素Samplehormone檢測(cè)含量*Detectioncontent*(μg/mL)回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Relativestandarddeviation(%)IAA9.36±1.3993.61.5ABA9.16±3.3991.66.4IBA8.43±0.8984.31.1ZT10.21±3.59102.16.1*:平均值±SD,SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。*:Mean±SD,SDstandsforstandarddeviation.

3．5．2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 分別向馬尾藻的空白基質(zhì)樣品中添加10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.3.2節(jié)的方法進(jìn)行處理，通過對(duì)比峰面積計(jì)算回收率，見表4。

結(jié)果表明，本方法回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。方法具有足夠的靈敏性，準(zhǔn)確可靠。

3.6 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證本方法的適用性和實(shí)用性，應(yīng)用本方法對(duì)采自東山島及市售的不同種類海藻(馬尾藻、海帶、龍須菜、海苔、紅藻)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，樣品中IAA植物激素含量均較高，1.59～15.93 μg/kg，遠(yuǎn)高于本方法的檢出限; 其它植物激素(如IBA, ABA, ZT)含量較低，分別為0.57～3.11 μg/kg, 0.08～0.29 μg/kg和0～0.30 μg/kg。同時(shí), 凈化方法在基質(zhì)效應(yīng)方面可以進(jìn)一步優(yōu)化，為海藻中的植物激素檢測(cè)分析提供一種可靠的方法。

4 結(jié) 論

本方法在樣品前處理凈化過程中，采用雙柱聯(lián)用凈化的方法，同時(shí)凈化并保留了酸性生長(zhǎng)素和堿性生長(zhǎng)素。使得可以同時(shí)檢測(cè)馬尾藻中的4種不同性質(zhì)的植物激素含量。本方法是一種簡(jiǎn)單有效快捷的方法，滿足對(duì)于馬尾藻植物激素的檢測(cè)需求，為海藻生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的商業(yè)化進(jìn)程提供技術(shù)支持。

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(Received 22 July 2015; accepted 18 September 2015)

Simultaneous Determination of 4 Kind of Plant Hormones in Sargassum by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

YI Yong1,2, TANG Xu1, LIN Xi-Huang1, LIU Yuan-Sen1, LIN Ling1, XU Chang-An*1

1(ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen361005,China)2(CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)

A method of simultaneous determination of four kind of auxins (Indole-3-acetic acid, Indole-3-butyric acid, Abscisic acid, Zeatin) in sargassum by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was established. After extracted by 70% methanol, the samples were enriched by the PCX and PAX solid-phase column. Then the samples were purified by reversed phase C18column using 5 mmol/L ammonium acetate (containing 0.01% formic acid) and methanol as a mobile phase in gradient elution. On the base of multiple reaction monitoring (MRM) analysis, the results showed that the correlation coefficient for all auxins examined exceeded 0.9990 in the range of 0.01-1.0 μg/mL. The recovery was from 84.3% to 102.1%, respectively. The relative standard deviation was less than 10%. Besides, the detection limit of this method was from 0.025 μg/kg to 0.2 μg/kg.

Sargassum; Double columns combination; Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Endogenous plant hormones

10.11895/j.issn.0253-3820.150585

本文系海洋公益性行業(yè)專項(xiàng)(No.201405038)、廈門南方海洋中心專項(xiàng)(No.14GZP004NF04)、國(guó)家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(海三科2013005)資助

2015-07-22收稿; 2015-09-18接受

* E-mail: xuchangan@tio.org.cn