邵紅霞，趙 巍，黃 健，錢 琨，葉建強，秦愛建

（1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

不同ELISA試劑盒檢測牛結(jié)核病效果比較

邵紅霞1,2，趙 巍1,2，黃 健1,2，錢 琨1,2，葉建強1,2，秦愛建1,2

（1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

本研究對自行研制的檢測牛γ干擾素的雙夾心ELISA試劑盒與商品化試劑盒進行了比較。用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對1255份經(jīng)牛PPD刺激的牛全血培養(yǎng)上清樣品進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94份陽性樣品，檢測陽性率為7.5%。同時用進口的ELISA試劑盒對其中的472份樣品進行了對比檢測，兩者陽性符合率為97.6%，陰性符合率為96.4%，總符合率為96.6%。比較檢測結(jié)果證明，自行研制的檢測牛γ干擾素的雙夾心ELISA試劑盒有很好的應(yīng)用前景。

檢測牛γ干擾素；雙夾心ELISA；比較

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是由分支桿菌感染引起的一種慢性消耗性的人畜共患病，不僅對畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響，而且還威脅人類的健康[1]。近年來，人結(jié)核病雖然處于有效控制中，但是仍然呈現(xiàn)一種緩慢上升趨勢[2]。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2011年我國感染肺結(jié)核的人數(shù)為953 275，死亡人數(shù)為2840。值得注意的是，人結(jié)核病中有10%左右是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的。因此，牛結(jié)核病的有效診斷和防治，對控制人結(jié)核病具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。目前，我國牛結(jié)核病的檢測方法主要有細菌學(xué)方法、PCR方法和免疫學(xué)方法等[9]。細菌學(xué)檢測雖然能確診牛結(jié)核，但是由于牛結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，分離率低，且需要特定實驗室，因此細菌學(xué)檢測應(yīng)用不廣[10]。PCR目前未能有效應(yīng)用于牛結(jié)核的檢測與診斷中。免疫學(xué)方法主要有結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ干擾素-ELISA[5,6]。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)由于其敏感性和特異性問題逐漸被淘汰。牛γ干擾素檢測牛結(jié)核的商用ELISA 試劑盒已經(jīng)在澳大利亞和歐美一些國家得到了廣泛的應(yīng)用[7]，已被OIE列為牛結(jié)核病診斷方法之一。本研究應(yīng)用兩株特異性抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1和6E5，建立了檢測牛γ干擾素雙夾心ELISA試劑盒，對臨床樣本進行了檢測，并與商品化ELISA試劑盒進行了比較。

1　材料與方法

1.1材料 BPPD購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；酶標儀購自BioTek公司；檢測牛γ干擾素雙夾心ELISA試劑盒，為本實驗室研制[3,4]和商品化的BOVIGAM采集試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 牛全血培養(yǎng)

1．2．1．1 采血 無菌采集12頭牛的抗凝血，每頭5ml。采集好的血液（含有抗凝劑）輕輕顛倒幾次充分混合。采血后30 h內(nèi)進行培養(yǎng)（抗凝血不能貯存于冰箱中）。

1．2．1．2 血液培養(yǎng) 血液培養(yǎng)前輕輕顛倒，充分混勻。由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要將細胞損傷降至最低。將12頭牛的血液樣品依次，且每頭牛的血液樣品加入24孔培養(yǎng)板，加2孔，每孔1．5 mL。用一次性自動移液器或吸管在無菌條件下進行操作。

1．2．1．3 加入刺激原 每頭牛的血液樣品，一孔無菌加入100μL PBS（陰性抗原對照）和一孔無菌加入100μL 牛型提純結(jié)核菌素（purified protein derivative from M·bovis，BPPD）。注：抗原必須與血液充分混勻，最好用一個微量振蕩器高速振蕩1

min。如果沒有合適的儀器，將培養(yǎng)板及其蓋緊緊固定在一起，在光滑的表面上順時針和逆時針各旋轉(zhuǎn)10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要讓血液附在蓋上，避免血液起泡。只有刺激抗原與血液完全混合，試驗才能達到最佳效果。

1．2．1．4 孵育 將含有血液和抗原的培養(yǎng)板放于37℃，CO2濕溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1．2．1．5 血漿樣品的收獲 用可調(diào)移液器小心吸取上層血漿，轉(zhuǎn)入獨立的1．5 mL離心管中。吸取血漿時應(yīng)盡量避免吸入細胞，若吸入少量紅細胞進行離心去除。

1．2．1．6 血漿的貯存 血漿可在2℃～8℃貯存7 d，在-20℃可貯存幾個月。貯存前，每個貯存管必須用合適的蓋子密封。檢測前，樣品需恢復(fù)至室溫并充分混勻。

1.2.2 試劑盒檢測 用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對經(jīng)BPPD刺激的1255份牛全血上清中牛γ干擾素進行檢測，同時用進口的BOVIGAM試劑盒對其中的472份樣本進行了同步對比檢測與分析。

2　結(jié)果

2.1 自行研制試劑盒與進口試劑盒對牛γ-干擾素檢測結(jié)果 用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對1255份牛全血刺激上清中牛γ-干擾素進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94份陽性樣品，檢測陽性率為7．5%。同時用進口的ELISA試劑盒對其中的472份牛全血刺激上清進行了對比檢測。在這472份樣品中，進口的ELISA試劑盒檢出82份陽性，自制ELISA試劑盒檢出94份陽性樣品，其中80份陰性樣品與進口ELISA試劑盒檢測結(jié)果相同，陽性符合率為 80/82=97．6%。自制ELISA試劑盒檢出陰性樣品376份，與進口ELISA試劑盒陰性符合率為376/390=96．4%，總符合率為（80+376）/（82+390）=96．6%。

2.2 不同奶牛場檢測結(jié)果分析 對某地區(qū)奶牛場A奶牛采樣875份牛血樣，選取部分樣本，用自制試劑盒進口試劑盒進行對比檢測，結(jié)果在所比對的346份樣本中，進口試劑盒檢測陽性樣本數(shù)為46份，自行研制的試劑盒陽性樣本數(shù)為52份，共同陽性的樣本數(shù)為45份，共同陰性的樣本為293份，總符合率為97．7%。陽性樣本的檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1　自制試劑盒與進口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差（陽性）Fig.1 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

對某奶牛場B的奶牛采樣22份，用自行研制試劑盒和進口試劑盒同時進行檢測，結(jié)果自制試劑盒檢測陽性樣本為5份，進口試劑盒檢測陽性樣本為4份，共同檢測出的陽性樣本為4份，共同陰性樣本為17份，符合率為95．5%。檢測結(jié)果詳見圖2。

對某奶牛場C的奶牛采樣92份牛血樣，自制ELISA試劑盒檢測出18份陽性樣品，74份陰性樣品。進口試劑盒檢測出16份陽性樣品，76份陰性樣品。兩者共同檢測出的陽性樣品15份，陰性樣品73份，總符合率為95．7%，陰性樣本檢測結(jié)果見圖3。

對某奶牛場D的奶牛，選取10份牛血樣，用自制試劑盒與進口試劑盒方法檢測結(jié)果均顯示，陽性樣品8份，陰性樣品2份。符合率為100%，結(jié)果見圖4。

圖2　自制試劑盒與進口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.2 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD--PBS

圖3　自制試劑盒與進口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.3 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

圖4　自制試劑盒與進口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.4 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

3　討論

牛結(jié)核是一種由牛分枝桿菌引起的臨床癥狀不典型的慢性消耗性疾病。因此，早期臨床檢查與診斷比較困難。在免疫學(xué)檢測方法中，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)被廣泛使用，但其靈敏性和特異性不高，檢測時間較長。1990年，Wood等[5]建立了通過檢測經(jīng)牛PPD刺激的牛全血釋放出來的γ干擾素，從而診斷牛結(jié)核病的ELISA方法。牛結(jié)核病γ干擾素檢測方法具有特異性好、靈敏度高等特點。目前，商品化的γ干擾素ELISA檢測試劑盒已在澳大利亞和歐美的一些國家得到應(yīng)用[8,10,11]，在我國也有一定應(yīng)用，但是價格十分昂貴。我國農(nóng)業(yè)部已提出凈化牛結(jié)核，并在十三五作為主要目標進行落實。因此，研制出高質(zhì)量的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的γ干擾素檢測試劑盒具有重要意義。本研究應(yīng)用自行研制的試劑盒能夠有效用于經(jīng)PPD刺激的牛全血培養(yǎng)中釋放出的牛γ干擾素，從而對牛結(jié)核病進行快速診斷。與進口商品化ELISA試劑盒比較研究發(fā)現(xiàn)，陽性符合率為97．6%、陰性符合率為96．4%，總符合率達96．6%。這些結(jié)果證明，自行研制的雙夾心ELISA試劑盒具有良好的特異性和靈敏性，可以應(yīng)用于臨床樣本的檢測，為我國牛結(jié)核病的檢疫和根除提供了一種實用、快速、有效的檢測工具，并展示了很好的應(yīng)用價值。

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COMPARISON OF DIFFERENT ELISA KITS FOR DETECTION OF BOVINE γ-IFN

SHAO Hong-xia1,2, ZHAO Wei1,2, HUANG Jian1,2, QIAN Kun1,2, YE Jian-qiang1,2, QIN Ai-jian1,2
(1. Ministry of Education Key Laboratory for Avian Preventive Medicine, Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To select high quality diagnostic kit for bovine tuberculosis, the domestic sandwich ELISA developed in our laboratory and a commercial ELISA kit were compared for detection of bovine γ-IFN in whole blood stimulated with BPPD. The positive percentage was 7.5% (94/1,255) with the domestic sandwich ELISA. Furthermore, 472 of these 1,255 samples were tested in both ELISA kits. Our data showed that the positive, negative and total agreement between the two ELISAs were 97.6%, 96.4% and 96.6%, respectively. The direct comparison demonstrated that the domestic sandwich ELISA developed in our laboratory had promising application for detection of bovine γ-IFN.

Bovine γ-IFN; sandwich ELISA; comparison

S852.618

A

1674-6422（2016）05-0029-04

2016-01-06

江蘇省科技支撐計劃（BE2013391）；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目

邵紅霞，女，博士，講師，主要從事動物病原學(xué)研究

秦愛建，E-mail : aijian@yzu．edu．cn