王耕，張薇，陳安東，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

肉類食品的動物物種基因鑒別及等溫擴(kuò)增熒光（IAFT）快速檢測技術(shù)的建立

王耕，張薇，陳安東，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

食品安全是國家公共安全的重要組成部分，直接影響人類健康、公共衛(wèi)生和社會穩(wěn)定。隨著全球性食品安全事件的持續(xù)發(fā)生，食品安全問題日益嚴(yán)峻。因此，建立快速、有效、精確的肉類制品物種鑒定技術(shù)和快速檢測方法已成為一項重大課題?；诖?，根據(jù)分子生物學(xué)基因擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展趨勢，集成核酸等溫擴(kuò)增核心技術(shù)，以等溫擴(kuò)增熒光快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，收集不同的動物物種樣品進(jìn)行基因序列分析，確定靶基因序列，針對目的片段設(shè)計特異引物，組合新型DN A聚合酶，在特定溫度條件下復(fù)制和擴(kuò)增，并與傳統(tǒng)PCR技術(shù)比較，篩選、優(yōu)化、建立了靈敏度更高、擴(kuò)增速度更快、特異性更強(qiáng)的肉類食品的動物物種基因鑒別SGI（Species gene identification）的等溫擴(kuò)增熒光（Isotherm al Am plification Fluorescent Technology，IAFT）快速檢測技術(shù)，并取得階段性成果，為食品安全的質(zhì)控和監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，作為肉類食品及其制品的現(xiàn)場快速物種特異鑒定的檢測手段。

肉類食品；等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)；成分鑒定

隨著歐洲“馬肉風(fēng)波”“蘇丹紅事件”“禽流感”“三鹿奶粉事件”等惡性食品安全事件的發(fā)生，食品安全監(jiān)管的執(zhí)行需要科學(xué)高效的檢測手段作為依據(jù)。因此，建立一套準(zhǔn)確、有效、現(xiàn)場應(yīng)用的快速檢測方法和體系，對維護(hù)人類健康和食品安全意義重大。

近年來，在動物肉類及其制品貿(mào)易中，不斷出現(xiàn)以次充好、以假亂真的現(xiàn)象，不良商家用低價值的雞、鴨、老鼠、狐貍?cè)獾燃尤肓又莆秳┟俺渑Ｑ蛉庵\取暴利，嚴(yán)重影響廣大消費者的健康和權(quán)益。在國際市場上，相繼出現(xiàn)以馬肉和驢肉冒充牛肉進(jìn)行銷售的惡劣行為，食品安全問題日益嚴(yán)峻[1]。因此，快速、有效、準(zhǔn)確地對畜禽肉類制品進(jìn)行種屬鑒定和快速檢測方法的建立是一項重要的研究課題。

突發(fā)性食品安全事件，不僅需要準(zhǔn)確有效的實驗室檢測手段，更需要建立和完善現(xiàn)場快速檢測方法，以便在第一時間和事件現(xiàn)場完成快速檢測，有效控制危害影響。目前，針對肉類食品動物物種基因鑒定的常規(guī)方法主要有常規(guī)PCR[2-4]和定量PCR技術(shù)[5-9]、ELISA技術(shù)[10]、近紅外光譜檢測[11]和色譜分析、等電聚焦、免疫擴(kuò)散、DNA雜交[12]等。其中，核酸檢測和抗原抗體檢測方法靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性較高；理化檢測法基于化學(xué)指標(biāo)檢測是一種間接檢測法，具有一定局限性，需依賴配套設(shè)備在實驗室操作，流程復(fù)雜，工作量大，對樣本要求高。通過本研究建立現(xiàn)場快速檢測方法和體系，為食品安全的質(zhì)控和監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐和科學(xué)的執(zhí)法依據(jù)有實用意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為超市隨機(jī)購買的豬、牛、羊、雞和鴨肉和常規(guī)加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸畜禽制品，以上述收集的動物物種樣品進(jìn)行基因序列分析，確定靶基因序列，作為引物設(shè)計的依據(jù)。

1.2試驗試劑

IAFT反應(yīng)試劑IMM購自英國Optigene公司；核酸快速提取試劑Fast Extraction kit來自北京晟泰勃科技有限公司；Buffer；Genesig Meat Speciation Kit；去離子無菌水。

1.3試驗儀器

現(xiàn)場核酸快速抽提系統(tǒng)用于現(xiàn)場抽提、制備、混勻，STP Suitsys100；實時等溫擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)Genie；梯度PCR儀，DNA-T Tercyc；常規(guī)采樣、加樣工具。

1.4引物設(shè)計與合成

以收集不同的動物物種樣品基因序列分析結(jié)果，經(jīng)對各物種核酸序列分析和比對，選擇各自保守區(qū)的特異性片段，設(shè)計、優(yōu)化并合成引物，稀釋備用。所設(shè)計引物為檢測豬、牛、羊、雞和鴨的引物組，每組包括FIP、BIP、F3、B3。

1.5樣本核酸提取

取樣100mg，破碎，據(jù)核酸快速提取試劑Fast Extraction kit要求抽提取上清備用。

1.6反應(yīng)體系配置

IMM 15μL；引物FIP（40pmol/μL）、BIP（40pmol/ μL）、F3 Primer（5pmol/μL）、B3 Primer（5pmol/ μL），各1μL；樣品4μL。

1.7程序設(shè)定

GenieⅡ程序設(shè)定：61℃，30min。

1.8特異性試驗

每次加入5組引物，分批次加入生豬、牛、羊、雞和鴨肉驗證引物特異性。

1.9靈敏度試驗

在牛肉中摻入豬肉，使豬肉含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%，各取100mg提取DNA，檢測豬肉成分。

1.10實際樣本檢測

豬、牛、羊、鴨肉罐頭和雞肉火腿腸加工制品，提取DNA后檢測，與PCR方法對比。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性試驗結(jié)果

按1.6中方法在8聯(lián)管中1～5號孔分別加入豬、牛、羊、雞和鴨肉引物和IMM（見表1），取豬肉據(jù)1.5提取DNA，取上清4μL加入1～5孔，按1.7設(shè)置程序，擴(kuò)增，結(jié)果顯示除1孔有擴(kuò)增以外其他孔均無擴(kuò)增和特異性溶解溫度，同法驗證牛、雞、鴨、羊肉引物和反應(yīng)體系特異性。

表1　各孔對應(yīng)引物組

圖1　特異性實驗擴(kuò)增曲線

圖2　各引物對豬肉特異性實驗擴(kuò)增曲線

表2　特異性實驗檢測結(jié)果

圖1和圖2中，加入生豬肉樣本后，只有豬引物對應(yīng)的1孔出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其余孔均無擴(kuò)增。表2為試驗結(jié)果，擴(kuò)增時間9min，溶解溫度為89.3℃。同法分別加入牛、羊、雞、鴨肉樣本，除對應(yīng)孔有擴(kuò)增外，其余孔均無擴(kuò)增，判定為陰性，驗證了各引物組的高度特異性。

2.2靈敏性試驗結(jié)果

按1.5提取DNA，檢測豬肉成分，結(jié)果見圖3，隨著豬肉成份含量降低，擴(kuò)增時間相應(yīng)變長，樣本含量和擴(kuò)增時間存在線性關(guān)系。且當(dāng)豬肉含量0.01%時，擴(kuò)增時間小于20min。驗證IAFT法高擴(kuò)增效率。

圖3　靈敏性試驗擴(kuò)增結(jié)果

2.3實際樣本鑒定結(jié)果

加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸，按1.5提取DNA，每組樣本使用IAFT法和PCR法做平行對比，驗證樣品中是否含豬、牛、羊、雞、鴨肉成分。

2.3.1肉類食品動物物種等溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)建立

在牛肉罐頭中未檢出牛肉成分，僅有豬肉和雞肉（見圖4和表3）；羊、豬、鴨的罐頭中分別只檢出羊肉成分、豬肉成分、鴨肉成分（分別見圖5～7和表4～6）；檢測的雞肉火腿腸中，只檢出雞肉成分（見圖8和表7）。

圖4　牛肉罐頭檢測擴(kuò)增圖

表3　牛肉罐頭檢測結(jié)果

圖5　羊肉罐頭檢測擴(kuò)增圖

表4　羊肉罐頭檢測結(jié)果

圖6　豬肉罐頭檢測擴(kuò)增圖

表5　豬肉罐頭檢測結(jié)果

圖7　鴨肉罐頭檢測擴(kuò)增圖

表6　鴨肉罐頭檢測結(jié)果

圖8　雞肉火腿腸檢測擴(kuò)增圖

表7　雞肉火腿腸檢測結(jié)果

2.3.2梯度PCR電泳結(jié)果

圖9～13為PCR檢測加工牛、羊、豬、鴨肉罐頭、雞肉火腿腸電泳圖。表8數(shù)據(jù)驗證了IAFT法和PCR法結(jié)果一致。

圖9　牛肉罐頭PCR檢測結(jié)果

圖10　羊肉罐頭檢測電泳圖

圖11　豬肉罐頭檢測電泳圖

圖12　鴨肉罐頭PCR檢測結(jié)果

圖13　鴨肉火腿腸PCR檢測結(jié)果

表8　PCR檢測結(jié)果

綜上所述，本研究通過對不同動物物種基因分析、比對、篩選確定靶基因序列的基礎(chǔ)上，經(jīng)優(yōu)化樣品前處理、引物設(shè)計，確立實驗程序和規(guī)范，完成特異性試驗、敏感性試驗、實際樣品鑒定并與相關(guān)常規(guī)方法比較，驗證和建立了肉類食品的動物物種基因鑒別的快速檢測技術(shù)。

3　討論

近年來出現(xiàn)的各種核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)[13，14]，對目的片段設(shè)計特異引物，使用新型DNA聚合酶在等溫條件下復(fù)制和擴(kuò)增，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)比較，更加靈敏、快速、特異，有多種結(jié)果分析和判定方法，如濁度法、鈣黃綠素法、電泳法、實時熒光法。其中，濁度和鈣黃綠素法是基于副產(chǎn)物的間接判定方法，準(zhǔn)確性和特異性欠佳。電泳判定依賴實驗室環(huán)境，易交叉污染，假陽性率高。

本研究以等溫擴(kuò)增熒光法（IAFT）為基礎(chǔ)建立了肉類食品的動物物種基因鑒定體系，與傳統(tǒng)PCR方法進(jìn)行對比，其結(jié)果符合率達(dá)到100%。實驗和應(yīng)用證明，IAFT是一種快速準(zhǔn)確的核酸檢測技術(shù)，集成并融合了核酸等溫擴(kuò)增和實時熒光檢測[15]，通過對產(chǎn)物做溶解曲線分析，對核酸進(jìn)行快速定性或定量。所需設(shè)備簡單、對樣本質(zhì)量要求較低、擴(kuò)增和結(jié)果檢測可同時完成，是樣品采集、快速制備、實時檢測、結(jié)果判定的現(xiàn)場核酸快速檢測配套技術(shù)體系，經(jīng)驗證是一種準(zhǔn)確、可靠、先進(jìn)的分子生物學(xué)基因快速檢測技術(shù)。融合了定量PCR的實時熒光檢測技術(shù)和樣本快速制備和抽提技術(shù)，適合于物種基因檢測、食品衛(wèi)生安全、進(jìn)出境口岸檢疫、疫情快速防控等領(lǐng)域的實驗室或現(xiàn)場核酸快速檢測。

4　結(jié)論

（1）集成核酸等溫擴(kuò)增核心技術(shù)，以等溫擴(kuò)增熒光快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)建立了肉類食品的動物基因鑒別及等溫擴(kuò)增熒光（IAFT）快速檢測技術(shù)體系。

（2）經(jīng)分析不同物種基因，確立靶基因序列并完成了引物設(shè)計，證明以等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)進(jìn)行肉類食品的動物基因鑒別，對于生物物種鑒別具有廣闊的應(yīng)用前景。

（3）經(jīng)與傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行比較和評價，表明等溫擴(kuò)增熒光快速檢測技術(shù)不僅可以替代常規(guī)PCR法，且更為特異、敏感、精確、快速和便捷，適合于任何條件下的現(xiàn)場快速檢測。

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Identification of Animal Species in Meat Food and Establishment of Rapid Detection Technology for Isothermal Amplification of Fluorescence (IAFT)

Wang Geng,Zhang Wei,Chen An-dong,Wang Zhen-chao
(Beijing Suntrap Science & Technology Co. Ltd.,Beijing 100097)

Food safety is an important part of the national public security,which directly affects human health,public health and social stability. With the global food safety incidents continue to occur,the food safety problem is increasingly severe. Therefore,the establishment of rapid,effective and accurate meat products species identification technology and rapid detection method has become a major issue. Based on this,according to the development trend of molecular biology gene amplification technology,integrated nucleic acid isothermal amplification core technology,based on the isothermal amplification fluorescence rapid detection technology,different animal species samples were collected for gene sequence analysis,the target gene sequence was identified,specific primers were designed for the target fragment,and the new DNA polymerase was combined to replicate and amplify under specific temperature conditions,and compared with the traditional PCR technology,screening,optimization and establishment isothermal amplification fluorescent (Isothermal Amplification Fluorescent Technology,IAFT) rapid detection technology that an animal species gene identification technology of meat products with higher sensitivity,faster amplification and stronger specificity SGI,and achieved initial results,to provide necessary technical support for the quality control and supervision of food safety,as a means of detection field of meat and its products for rapid identification of specific species.

Meat food; Isothermal amplification fluorescence technique; Component identification

TS251.7

A

2096-0387（2016）05-0021-06

王耕(1986-),男,陜西西安人，本科,工程師,研究方向:食品安全快速檢。