鄧莎莎，吳繼軍,，劉忠義，余元善，徐玉娟

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

二甲基二碳酸鹽發(fā)酵前處理對(duì)茶枝柑果酒發(fā)酵特性的影響

鄧莎莎1,2，吳繼軍1,2,*，劉忠義2，余元善1，徐玉娟1

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

為探究二甲基二碳酸鹽（dimethyl dicarbonate，DMDC）非熱殺菌技術(shù)對(duì)茶枝柑果酒發(fā)酵特性及果酒品質(zhì)的影響，將新鮮茶枝柑果汁分別進(jìn)行DMDC殺菌、巴氏殺菌和不殺菌處理，比較3 種不同的發(fā)酵前處理方法對(duì)發(fā)酵期間可溶性固形物含量、糖組分、乙醇含量、高級(jí)醇含量、pH值、總酸含量、有機(jī)酸含量、抗壞血酸含量、抗氧化活性等動(dòng)態(tài)指標(biāo)的影響以及發(fā)酵前后微生物菌群的差異。結(jié)果表明：相對(duì)于未殺菌直接發(fā)酵的茶枝柑發(fā)酵液，添加DMDC和巴氏殺菌均能有效殺滅污染的雜菌，提高糖的有效利用率和乙醇得率，抑制高級(jí)醇產(chǎn)生，其中空白對(duì)照組（不殺菌處理）、DMDC組、巴氏殺菌組的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為13.10%、13.30%、13.73%。同時(shí)，與巴氏殺菌組相比，DMDC處理后的發(fā)酵液抗壞血酸質(zhì)量濃度較高（211.40～221.70 mg/L），抗氧化活性保留較好（20.83～23.26 μmol TE/mL）；但存在乳酸菌等耐受菌殘留、乳酸升高的問題。綜合而言，DMDC殺菌可以作為茶枝柑果酒發(fā)酵前處理的非熱殺菌技術(shù)進(jìn)行深入研究。

二甲基二碳酸鹽；巴氏殺菌；茶枝柑果酒；發(fā)酵特性；非熱殺菌

主產(chǎn)于廣東新會(huì)的茶枝柑，已有700多年栽培歷史，因其果皮有藥用和食療價(jià)值而聞名海內(nèi)外。在傳統(tǒng)茶枝柑產(chǎn)業(yè)中，種植茶枝柑的目的就是剝?nèi)」ぶ谱髦兴幉摹獜V陳皮。由于茶枝柑果肉味酸籽多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過80%的果肉（含果籽）除少量鮮食外，大多拋棄到田間路邊，不僅浪費(fèi)了資源，而且污染了環(huán)境[1]。事實(shí)上，茶枝柑果肉有重要的開發(fā)利用價(jià)值。研究表明，茶枝柑果肉中富含糖類、有機(jī)酸、天然維生素、抗氧化活性物質(zhì)等，具有很高的食用和藥用價(jià)值[2]。因此利用茶枝柑果肉釀酒，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)資源的綜合利用，還能使茶枝柑中的有效藥理成分和果酒自身的營養(yǎng)保健功能相結(jié)合，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和巨大的市場(chǎng)推廣前景。

在茶枝柑果酒釀制前，剝皮、打漿、榨汁等處理步驟會(huì)使發(fā)酵液不可避免地受到一些雜菌的污染，這些雜菌的存在不僅會(huì)影響發(fā)酵的正常進(jìn)行，而且會(huì)形成潛在的食品安全隱患。目前，大中型果酒生產(chǎn)企業(yè)發(fā)酵前殺菌處理以熱殺菌為主，一些小型企業(yè)為降低生產(chǎn)成本多采用不殺菌直接發(fā)酵的方式[3]。熱殺菌具有很好的殺菌效果，它能使腐敗菌和致病菌快速失活而得到抑制，但由于果汁對(duì)熱敏感，熱殺菌處理后會(huì)導(dǎo)致特色果酒營養(yǎng)價(jià)值劣變、整體品質(zhì)降低。而不殺菌直接發(fā)酵的方式使得發(fā)酵體系中污染菌增多，不僅難以保證發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的一致性，而且存在食品安全問題。因此，大力開發(fā)應(yīng)用一些方便、高效、安全的冷殺菌技術(shù)是發(fā)展茶枝柑果酒產(chǎn)業(yè)的重要課題。

二甲基二碳酸鹽（dimethyl dicarbonate，DMDC）屬于焦碳酸酯類，因其具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，能與多種基團(tuán)（如巰基、羥基、氨基和羧基）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[4]。研究表明，其在常溫甚至低溫下對(duì)很多污染菌有較強(qiáng)的殺滅能力，且在水中很快分解為微量的甲醇和二氧化碳，不會(huì)影響人體健康和產(chǎn)品品質(zhì)[5-7]，故DMDC殺菌是一種很有潛力的非熱殺菌技術(shù)。目前，許多國家已經(jīng)批準(zhǔn)DMDC作為微生物抑制劑應(yīng)用在酒飲料、碳酸飲料、果汁飲料，甚至是100%全果汁中[4]。關(guān)于DMDC發(fā)酵前處理的研究多集中于荔枝[8-9]、桑果[10]、蘋果[11]、葡萄[12]等低酸性水果果汁，而對(duì)茶枝柑等高酸性水果果汁發(fā)酵特性的研究還鮮見報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過分析比較DMDC殺菌、巴氏殺菌、不殺菌處理后，發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液主要品質(zhì)指標(biāo)的變化，探討DMDC用于茶枝柑果酒加工的可行性，以期為DMDC殺菌技術(shù)在茶枝柑果酒加工中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮新會(huì)茶枝柑于當(dāng)天在廣東省江門市新會(huì)陳皮村合作社采摘；DMDC 美國Sigma公司；葡萄酒活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、MRS瓊脂、胰胨大豆瓊脂斜面（tryptic soy agar，TSA）、孟加拉紅瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Infinite M200PRO型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；PB-10型PH計(jì) 德國Sartorius公司；酸堿滴定儀 上海儀電科技股份有限公司；DMA35型密度計(jì) 奧地利Anton Paar有限公司；阿貝折光儀 英國Stanley公司；LC1200型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有可變波長紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光檢測(cè)器和LabSolutions工作站） 日本島津公司；6890N/5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有G1701DA GC-MSD化學(xué)工作站） 美國安捷倫科技有限公司；Biofuge Stratos Sorvall型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 茶枝柑果汁的制備

將茶枝柑鮮果進(jìn)行揀選、清洗、去皮、壓榨汁，然后過100目濾布（除去瓤衣和果核），得到茶枝柑果汁，其出汁率為41.26%，pH值為3.54，總酸質(zhì)量濃度為9.37 g/L，可溶性固形物含量為9.08°Brix。在茶枝柑果汁中添加蔗糖，使其可溶性固形物含量達(dá)到（23.00±0.26）。

1.3.2 茶枝柑果汁的發(fā)酵前處理

茶枝柑果汁的發(fā)酵分為3 種不同前處理方式?？瞻讓?duì)照組：茶枝柑果汁直接接入活化的釀酒酵母，混合均勻；DMDC組：茶枝柑果汁經(jīng)DMDC（終質(zhì)量濃度為250 mg/L）殺菌處理3 h后，接入活化的釀酒酵母，混合均勻；巴氏殺菌組：茶枝柑果汁煮沸1 min，迅速冷卻至室溫，接入活化的釀酒酵母，混合均勻。其中，酵母菌接種量為當(dāng)量干酵母粉0.2 g/L。

安琪葡萄酒專用酵母活化方法參考產(chǎn)品說明：干酵母粉用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%滅菌蔗糖水在30 ℃活化30 min，其中酵母均活化質(zhì)量濃度為20 g/L。

3組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液分別置于20 ℃發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，每隔24 h取樣測(cè)定其理化指標(biāo)及發(fā)酵前后微生物菌體濃度。

1.3.3 發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 可溶性固形物含量和糖組分質(zhì)量濃度測(cè)定

可溶性固形物含量：采用手持便攜式折光儀在室溫測(cè)定，具體操作參考GB 12143.1—1989《軟飲料中可溶性固形物的測(cè)定方法 折光計(jì)法》。

糖組分測(cè)定：將茶枝柑發(fā)酵液與無水乙醇以體積比1∶1混合離心，上清液過0.22 μm濾膜用于后續(xù)的HPLC分析。色譜條件為：Shodex Asahipak NH2P-504E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，ELSD漂移管溫度40 ℃；流動(dòng)相75%乙腈，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，用外標(biāo)法定量[9]。

1.3.3.2 pH值、總酸含量和有機(jī)酸含量測(cè)定

pH值測(cè)定：采用酸度計(jì)直接測(cè)定；總酸含量測(cè)定：參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，總酸度以酒石酸計(jì)。

有機(jī)酸含量測(cè)定：采用HPLC測(cè)定，將茶枝柑發(fā)酵液與蒸餾水以體積比1∶1混合離心，上清液過0.22 μm濾膜用于后續(xù)的HPLC分析，采用基于峰面積的外標(biāo)法定量。色譜條件為：Agilent Zorbax Carbohydrate色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動(dòng)相0.1 mol/L磷酸二氫銨（pH 2.7），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)波長210 nm[9]。

1.3.3.3 酒精度和高級(jí)醇測(cè)定

參考GB/T 15038—2006方法，取50 mL茶枝柑發(fā)酵液置于500 mL圓底燒瓶中，添加50 mL蒸餾水，蒸餾出50 mL樣品。

酒精度測(cè)定：采用密度計(jì)直接測(cè)定；高級(jí)醇測(cè)定：蒸餾樣液經(jīng)二氯甲烷按體積比1∶1萃取3次，合并有機(jī)相，旋蒸濃縮至1倍體積，用氣相色譜-質(zhì)譜和外標(biāo)法分析測(cè)定其質(zhì)量濃度。

氣相色譜-質(zhì)譜的色譜條件為：采用DB-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫方式為初始溫度45 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的速率升至130 ℃并保持2 min；氦氣流速為20 mL/min，分流比為10∶1；進(jìn)樣口溫度為160 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；氣相色譜-質(zhì)譜條件為電子轟擊電離離子源（70 eV），離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 10～450。

1.3.3.4 抗壞血酸質(zhì)量濃度和抗氧化活性測(cè)定

抗壞血酸質(zhì)量濃度測(cè)定：同有機(jī)酸測(cè)定，紫外檢測(cè)波長為245 nm。

抗氧化活性測(cè)定：采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法測(cè)定，參考Prior[13]、續(xù)潔琨[14]等的方法，將80 μL 1.25 μmol/L現(xiàn)配的熒光素鈉溶液（溶劑為75 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）和20 μL茶枝柑發(fā)酵液添加入酶標(biāo)板中，37 ℃避光反應(yīng)5 min。再加入100 μL 140 mmol/L現(xiàn)配的偶氮二異丁脒鹽酸鹽溶液（溶劑為75 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）。酶標(biāo)儀測(cè)定條件：激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長520 nm，多點(diǎn)測(cè)定循環(huán)：循環(huán)35 次，每次150 s。以蒸餾水為空白對(duì)照。測(cè)定結(jié)果以μmol TE（Trolox equivalent）/mL表示。

1.3.4 發(fā)酵前后茶枝柑發(fā)酵液微生物量的測(cè)定

參考GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》、GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》、GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，采用稀釋倒平板法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后的菌落總數(shù)、酵母菌數(shù)以及乳酸菌數(shù)。菌落總數(shù)采用PCA瓊脂，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后計(jì)數(shù)；酵母菌采用孟加拉紅瓊脂，乳酸菌采用MRS瓊脂，均在30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后計(jì)數(shù)；結(jié)果以每毫升茶枝柑發(fā)酵液中菌落數(shù)的常用對(duì)數(shù)值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的不同處理均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，并用Microcal Origin 7.5軟件制圖。顯著性水平取0.05，數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后茶枝柑發(fā)酵液中微生物情況

表1 發(fā)酵前后茶枝柑發(fā)酵液中的微生物菌體濃度Table 1 Microbial biomass of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit juice before and after fermentation lg（CFU/mL）

由表1可知，在去皮、壓榨汁等的過程中，茶枝柑果汁污染了大量微生物，主要為酵母菌、乳酸菌。發(fā)酵結(jié)束后不同發(fā)酵組的菌落總數(shù)有顯著差異（P＜0.05），其中DMDC組含菌量最高，巴氏殺菌組含菌量次之，空白對(duì)照組含菌量最低。進(jìn)一步組內(nèi)、組間對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，DMDC組和巴氏殺菌組的酵母菌含量沒有顯著差異（P＞0.05），均高于空白對(duì)照組。組間乳酸菌含量存在顯著差異，順序依次為DMDC組＞空白對(duì)照組＞巴氏殺菌組。不難發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌組中酵母菌是優(yōu)勢(shì)菌，DMDC組中乳酸菌和酵母菌是優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)照組中酵母菌、乳酸菌及其他雜菌的菌體濃度均介于7.00～8.00 （lg（CFU/mL）），其雜菌菌體濃度在3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中最高。這應(yīng)該是由于3個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵前的處理方式不同所致。一些研究發(fā)現(xiàn)，DMDC對(duì)酵母菌的殺菌能力最強(qiáng)，而乳酸菌是DMDC的耐受菌[4,12]，使得DMDC組殘留的乳酸菌在發(fā)酵中進(jìn)一步生長繁殖；巴氏殺菌能有效殺滅雜菌，使得接種的酵母菌有適宜的生長環(huán)境，繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌；而空白對(duì)照組因?yàn)闆]有采取任何抑菌措施，使得發(fā)酵液污染的雜菌抑制了酵母菌的生長。

2.2 發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液中可溶性固形物含量和糖組分的變化

圖1 茶枝柑果酒發(fā)酵期間可溶性固形物（a）、葡萄糖（b）、蔗糖（c）、果糖（d）含量的變化Fig. 1 Changes in total soluble solid (a), glucose (b), sucrose (c) and fructose (d) during fermentation of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，茶枝柑發(fā)酵液中的可溶性固形物、蔗糖、果糖、葡萄糖含量逐漸降低。在發(fā)酵前期，可溶性固形物及各糖組分下降較快，發(fā)酵后期下降趨于平緩。發(fā)酵期間3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的可溶性固形物含量均呈下降趨勢(shì)，測(cè)定DMDC組殺菌處理前后可溶性固形物含量沒有變化，巴氏殺菌組熱處理后可溶性固形物含量由23.26°Brix升至24.76°Brix，這主要是因?yàn)闊崽幚硎沟盟謸]發(fā)，固形物濃縮，淀粉、果膠以及蔗糖水解（巴氏殺菌后測(cè)定發(fā)酵液中蔗糖質(zhì)量濃度由216.24 g/L下降至175.72 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度由25.90 g/L上升至51.63 g/L、果糖質(zhì)量濃度由26.88 g/L上升至48.38 g/L）等原因綜合所致。

空白對(duì)照組的葡萄糖、蔗糖、果糖分別在發(fā)酵第3、6、8天不再顯著下降（P＞0.05）；DMDC組的葡萄糖、蔗糖、果糖分別在發(fā)酵第4、6、8天不再顯著下降（P＞0.05）；巴氏殺菌組的葡萄糖、蔗糖、果糖分別在發(fā)酵第4、7、9天不再顯著下降（P＞0.05）。這應(yīng)該是由于3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中含有的微生物菌落濃度不同所致，對(duì)照組因發(fā)酵前沒有進(jìn)行過任何滅菌處理，起始菌大量存在使得各糖組分更早的消耗完。巴氏殺菌組能有效殺菌污染菌，接種的釀酒酵母經(jīng)過一段時(shí)間的生長繁殖達(dá)到一定數(shù)量，才開始高效進(jìn)行糖消耗和轉(zhuǎn)化。

2.3 發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液中pH值、總酸和有機(jī)酸含量的變化

圖2 茶枝柑果酒發(fā)酵期間pH值、總酸（a）、檸檬酸（b）、乳酸（c）、草酸（d）含量的變化Fig. 2 Changes in pH, total acid (a), citric acid (b), lactic acid (c) and oxalic acid (d) during fermentation of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine

由圖2a可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中總酸質(zhì)量濃度逐漸增加，pH值也逐漸升高，這可能是由于發(fā)酵過程中一些酸性較強(qiáng)的有機(jī)酸減少，而另一些酸性較弱的有機(jī)酸生成較多，最終導(dǎo)致總酸質(zhì)量濃度增加，pH值相應(yīng)升高。其中，DMDC組和空白對(duì)照組總酸質(zhì)量濃度持續(xù)升高。與空白對(duì)照組相比，發(fā)酵后期DMDC組和巴氏殺菌組pH值升高較顯著，且DMDC組高于巴氏殺菌組。

發(fā)酵液中檸檬酸、乳酸、草酸含量的變化情況見圖2b～d。這3種有機(jī)酸的酸性強(qiáng)弱依次為檸檬酸＞乳酸＞草酸。HPLC分析表明，檸檬酸在茶枝柑果汁的有機(jī)酸中質(zhì)量濃度最高（8.89 g/L），是茶枝柑的主體酸味成分，這與白衛(wèi)東等[15]對(duì)新會(huì)柑果汁成分分析的研究結(jié)論相同。其中，空白對(duì)照組和DMDC組檸檬酸質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)出不同程度的下降，發(fā)酵結(jié)束分別維持在8.25～8.51、7.49～7.70 g/L之間。巴氏殺菌組檸檬酸質(zhì)量濃度沒有顯著變化，這可能與熱處理水分揮發(fā)，使得檸檬酸發(fā)酵起始質(zhì)量濃度增加有關(guān)。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的乳酸質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)出不同程度升高，發(fā)酵4 d以后質(zhì)量濃度不再顯著增加，分別維持在658.70～726.90、621.80～704.90、477.30～531.70 mg/L之間，這應(yīng)該是由于發(fā)酵液中原始乳酸菌菌體濃度不同造成的。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組草酸質(zhì)量濃度均呈下降趨勢(shì)，至發(fā)酵第10天分別由原始的328.40、309.04、502.33 mg/L下降至同一水平（41.86～46.72 mg/L）。

2.4 發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液中酒精度和高級(jí)醇質(zhì)量濃度的變化

圖3 茶枝柑果酒發(fā)酵期間酒精度（a）、異丁醇（b）、異戊醇（c）、活性戊醇（d）含量的變化Fig. 3 Changes in alcohol (a), isobutanol (b), isoamylol (c) and active-amyl alcohol (d) during fermentation of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine

由圖3可知，發(fā)酵期間3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的乙醇體積分?jǐn)?shù)均呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)空白對(duì)照組、DMDC組、巴氏殺菌組的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為13.10%、13.30%、13.73%，并且有顯著性差異（P＜0.05）。適量的高級(jí)醇能使酒體豐富，口味協(xié)調(diào)，給人以醇厚的感覺，但如果含量過高，由于高級(jí)醇的分子質(zhì)量比較大，進(jìn)入人體后，很難迅速被代謝，就會(huì)產(chǎn)生“上頭”感覺。如果發(fā)酵液中缺乏酵母生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)，酵母生長就會(huì)受到抑制，產(chǎn)生過多的高級(jí)醇[16-17]。楊小蘭[17]、朱靜[18]等均就如何降低啤酒、果酒中的高級(jí)醇做了研究。由圖3可知，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的異丁醇質(zhì)量濃度分別在發(fā)酵第4、5、3天不再顯著上升（P＞0.05），分別維持在95.59～137.04、103.14～133.36 、51.49～91.68 mg/L之間；3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的異戊醇質(zhì)量濃度分別在發(fā)酵第6、7、6天不再顯著上升（P＞0.05），分別維持在476.48～569.53、509.67～557.83、386.64～482.36 mg/L之間；3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的活性戊醇質(zhì)量濃度分別在發(fā)酵第6、7、8天不再顯著上升（P＞0.05），分別維持在74.50～105.63、72.77～88.82、54.55～77.43 mg/L之間。這表明，對(duì)于抑制高級(jí)醇的產(chǎn)生而言，巴氏殺菌組發(fā)酵液所含的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境更適于酵母菌生長，DMDC組次之，對(duì)照組最差。

2.5 發(fā)酵期間茶枝柑發(fā)酵液中抗壞血酸質(zhì)量濃度和抗氧化活性的變化

圖4 茶枝柑果酒發(fā)酵期間抗壞血酸質(zhì)量濃度和抗氧化活性的變化Fig. 4 Changes in ascorbic acid and antioxidant activity during fermentation of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長抗壞血酸質(zhì)量濃度呈緩慢上升趨勢(shì)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗壞血酸質(zhì)量濃度分別維持在217.30～238.00、211.40～221.70、202.40～221.40 mg/L之間。顯而易見，發(fā)酵過程中DMDC組抗壞血酸平均質(zhì)量濃度介于巴氏殺菌組與空白對(duì)照組之間，這是由于茶枝柑發(fā)酵液經(jīng)熱處理后，抗壞血酸熱分解嚴(yán)重，使得發(fā)酵期間抗壞血酸質(zhì)量濃度顯著低于另外兩實(shí)驗(yàn)組。Roig等[19]報(bào)道在橙汁等抗壞血酸含量高的果汁中抗壞血酸降解是引起褐變的主要因素。而空白對(duì)照組之所以有高的抗壞血酸質(zhì)量濃度，可能是因?yàn)榇罅吭嘉⑸镄玛惔x消耗了茶枝柑發(fā)酵液中溶解的氧，從而抑制了抗壞血酸的有氧降解[20]。有報(bào)道稱有氧降解速率是無氧降解速率的100～1 000 倍[21]，也可能是因發(fā)酵起始菌中含有很多雜菌，其通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一定量的抗壞血酸，具體原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

ORAC是對(duì)樣品的相對(duì)總抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)的一種最簡單、準(zhǔn)確的分析方法。由圖4抗壞血酸質(zhì)量濃度和抗氧化活性的變化趨勢(shì)可知，抗壞血酸質(zhì)量濃度和抗氧化活性存在一定的正相關(guān)性。但茶枝柑發(fā)酵液的抗氧化能力受多種生物活性成分影響，如黃酮、多酚、果膠等[22]。所以僅僅用抗壞血酸質(zhì)量濃度變化不足以表征發(fā)酵液的抗氧化活性。對(duì)比3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的抗氧化活性可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液的抗氧化活性均呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵后期（5～10 d），3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的抗氧化活性呈現(xiàn)出穩(wěn)定差異性，DMDC組抗氧化活性最高，巴氏殺菌組次之，空白對(duì)照組最低，這應(yīng)該是微生物代謝、氧氣氧化、熱處理損失等綜合作用的結(jié)果。

3 討論

目前利用茶枝柑果汁釀酒的前處理殺菌方式多為熱處理，但因果汁中含有大量的熱敏性營養(yǎng)及功能成分，例如，抗壞血酸質(zhì)量濃度為217.21 mg/L，抗氧化活性為21.86 μmol TE/mL，以及多酚、果膠等。采用常規(guī)的熱處理加工方式易使產(chǎn)品營養(yǎng)及功能成分損失嚴(yán)重，所以利用非熱加工技術(shù)將是茶枝柑果汁加工的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。結(jié)合茶枝柑果汁低pH值（pH 3.54）的特殊性，以及DMDC最適殺菌pH值范圍（pH 3.0～4.0）[4,7]，探討DMDC發(fā)酵前處理對(duì)茶枝柑果酒發(fā)酵特性的影響有非常必要的研究意義。

研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)殺菌的茶枝柑發(fā)酵液，因?yàn)榘l(fā)酵起始雜菌的大量存在，使得可溶性固形物和各種糖組分較快被消耗和轉(zhuǎn)化。同時(shí)，伴隨著發(fā)酵液中有機(jī)酸總量顯著增加，pH值改變。由于酵母轉(zhuǎn)化生成乙醇的底物有所減少以及環(huán)境條件的改變，使得空白對(duì)照組的乙醇生成量較少，而雜菌降解產(chǎn)生的氨基酸較多，導(dǎo)致高級(jí)醇含量較高。巴氏殺菌能有效殺滅茶枝柑發(fā)酵液污染的雜菌，使得發(fā)酵液中的糖分能充分被酵母利用，更多的轉(zhuǎn)化生成乙醇，提高酒精度。同時(shí)也能避免高含量的高級(jí)醇和有機(jī)酸生成。但是，高溫?zé)崽幚硎沟冒l(fā)酵液中的抗壞血酸和抗氧化活性顯著降低。

DMDC冷殺菌技術(shù)能在一定程度上殺滅污染的雜菌，相對(duì)于空白對(duì)照組，能使發(fā)酵液中的糖分更有效地轉(zhuǎn)化為乙醇，高級(jí)醇產(chǎn)生量也相對(duì)較少。相對(duì)于熱殺菌而言，使得發(fā)酵產(chǎn)品中的活性成分保留較好。但由于有一些DMDC耐受菌（乳酸菌）的存在，使得發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一定量的有機(jī)酸（乳酸等）。所以，有必要進(jìn)一步研究DMDC與其他非熱殺菌技術(shù)協(xié)同殺菌的工藝。此外，關(guān)于DMDC發(fā)酵前處理對(duì)茶枝柑果酒發(fā)酵感官特性的研究也有待深入開展。綜合而言，DMDC冷殺菌技術(shù)可以作為茶枝柑果酒發(fā)酵前處理的技術(shù)進(jìn)行深入研究。

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Effect of Dimethyl Dicarbonate Pretreatment on Fermentation Characteristics of Citrus reticulata cv. Chachiensis Fruit Wine

DENG Shasha1,2, WU Jijun1,2,*, LIU Zhongyi2, YU Yuanshan1, XU Yujuan1
(1. Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture, Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China; 2. College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)

The paper aimed to explore the effect of dimethyl dicarbonate (DMDC) pretreatment as a non-thermal sterilization technology on the fermentation characteristics and quality of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine. The effects of DMDC sterilization and pasteurization on the changes in quality indicators such as total soluble solid, ethanol, higher alcohol, total acid, organic acid and ascorbic acid contents, sugar composition, pH and antioxidant activity during the fermentation process and the differences in the microbial community before and after fermentation were compared with those of the non-sterilized control. Results showed that both DMDC addition and pasteurization could improve the effective utilization of sugar and the yield of ethanol and restrain the synthesis of fusel by killing unwanted bacteria when compared with the control. The ethanol contents of the control, DMDC treatment, and pasteurization treatment were 13.10%, 13.30%, and 13.73%, respectively. Importantly, when compared with pasteurization, DMDC treatment gave higher ascorbic acid concentration (211.40-221.70 mg/L) and antioxidant activity (20.83-23.26 μmol TE/mL) in fermented Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit juice. However, DMDC treatment showed higher residues of resistant bacteria such as Lactobacillus and an increment of lactic acid. To sum up, DMDC sterilization is worthy of further investigation for application as a non-thermal sterilization technology in sample pretreatment for the fermentation of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine.

dimethyl dicarbonate; pasteurization; Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine; fermentation characteristics; non-thermal sterilization

10.7506/spkx1002-6630-201621002

S571.9

A

1002-6630（2016）21-0007-07

引文格式：

鄧莎莎, 吳繼軍, 劉忠義, 等. 二甲基二碳酸鹽發(fā)酵前處理對(duì)茶枝柑果酒發(fā)酵特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 7-13. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621002. http://www.spkx.net.cn

DENG Shasha, WU Jijun, LIU Zhongyi, et al. Effect of dimethyl dicarbonate pretreatment on fermentation characteristics of Citrus reticulata cv. Chachiensis fruit wine[J]. Food Science, 2016, 37(21): 7-13. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621002. http://www.spkx.net.cn

2016-01-07

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401531）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030312001）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B020204001）

鄧莎莎（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與食品加工。E-mail：565271175@qq.com

*通信作者：吳繼軍（1976—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)楣呱罴庸?。E-mail：wujijun@126.com