張鵬英，常藕琴，石存斌 ，吳淑勤

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣州 510380;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

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3月齡草魚種免疫器官組織學及其免疫后免疫基因的轉(zhuǎn)錄差異

張鵬英1，2，常藕琴1，石存斌1，吳淑勤1

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣州 510380;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

為研究處于同一時期但養(yǎng)殖條件不同的草魚(Ctenopharyngodonidellus)魚體規(guī)格與發(fā)育狀態(tài)間是否具有一致性，觀察壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟的顯微結(jié)構(gòu)，并對壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚進行腹腔注射疫苗處理，實時熒光定量PCR檢測免疫7 d后、14 d后各期草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟中IgM與MHCⅠ的表達量。結(jié)果顯示，壓塘3月齡草魚各組織發(fā)育較普通3月齡草魚遲緩。壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚在免疫后，頭腎、中腎、腸道與脾臟中IgM和MHCⅠ的表達量均有上升，且IgM與MHCⅠ的相對表達量峰值均出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中(IgM為74.51倍；MHCⅠ為56.02倍。結(jié)果表明，草魚出血病活疫苗可以增強草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟中IgM和MHCⅠ的表達，且在3月齡時期進行注射免疫效果最佳。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)；免疫器官組織學；疫苗免疫；IgM；MHCⅠ

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，但在養(yǎng)殖過程中的“四病”(赤皮病、爛鰓病、腸炎病、出血病)一直制約著草魚養(yǎng)殖的發(fā)展[1]。其中草魚出血病是流行地區(qū)最廣、季節(jié)最長、危害最大的一種流行病，該病由草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus， GCRV)引起，是魚種培育階段的最大病害[2]。利用免疫手段提高魚類獲得性免疫力可以防治魚類疾病[3]，預防草魚出血病最有效的方法是接種疫苗[4]，實踐表明，草魚經(jīng)免疫后成活率大大提高，目前中國每年有數(shù)十億草魚苗種受益于疫苗免疫[5]。魚類疫苗的免疫接種方法有注射、浸泡、口服和基因槍接種4 種方式，其中注射免疫能使魚類免疫接種取得較好效果[6]。有研究表明，草魚出血病疫苗能夠在一定時間內(nèi)起到抗感染的免疫效果[7]。通常情況下，魚種在培育到一定規(guī)格后，會進行分塘養(yǎng)殖以降低養(yǎng)殖密度，促進魚種生長。然而近年來，許多養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟效益，將部分魚種壓塘養(yǎng)殖以錯峰銷售。壓塘魚由于養(yǎng)殖密度過大，投喂飼料不足等問題，比正常養(yǎng)殖魚的生長發(fā)育遲緩。養(yǎng)殖過程中一般3月齡魚進行免疫對魚病有較好的預防效果。壓塘和正常養(yǎng)殖3月齡魚頭腎、中腎、腸道、脾臟等免疫組織結(jié)構(gòu)及免疫相關(guān)因子間是否存在差異，可否同期免疫，尚未見相關(guān)資料和報道。本研究使用組織切片和實時熒光定量PCR技術(shù)對壓塘和正常養(yǎng)殖3月齡魚免疫器官組織學和免疫相關(guān)基因進行研究，為進一步探討草魚出血病活疫苗在草魚出血病的防治中的使用時間與免疫組織結(jié)構(gòu)成熟度和免疫時機的關(guān)系，為免疫器官發(fā)育和免疫組織學研究提供基礎(chǔ)資料，為草魚疫苗更好地發(fā)揮作用提供科學依據(jù)，對疫苗應用、免疫防治具有重要的實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚均來自廣東省清遠市百容水產(chǎn)良種有限公司，壓塘3月齡草魚體長( 4.6±0.6) cm，體質(zhì)量(1.0±0.5) g，普通3月齡草魚體長(15.4±0.9) cm，體質(zhì)量( 47.4±18.1) g。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit 、熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq II 和RNAiso Plus均購自TaKaRa 公司、RNAhold 購自北京全氏金生物公司，熒光定量PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品、臺式冷凍離心機為上海人和科學儀器有限公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成，注射用疫苗草魚出血病減毒活疫苗(GCHV-892株)由中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所疫苗工程中心饋贈。

1.2 實驗方法

組織取樣 取壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚的頭腎、中腎、腸道(腸后段)和脾臟組織。組織大小和形狀允許的，以1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm的規(guī)格取材，體積過小的則整體取出。取材完成后立即置于Bouin′s液中進行固定，24 h后將組織塊置于70 %酒精中。

常規(guī)石蠟切片制作 固定完成后，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋后，3 μm縱向連續(xù)切片，切片烘干后進行H.E 染色，中性樹膠封片。然后將切片置于LEICA DM750 型顯微鏡下觀察，LEICA ICC50 HD 型攝像頭下拍照。

草魚的免疫 選取健康的壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚各30條進行疫苗腹腔注射。壓塘3月齡草魚每尾注射100 μL、普通3月齡草魚每尾注射150 μL。

常規(guī)石蠟切片制作 組織用Bouin′s液固定完成后，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋后，3 μm縱向連續(xù)切片，切片烘干后進行H.E 染色，中性樹膠封片。然后將切片置于LEICA DM750 型顯微鏡下觀察，LEICA ICC50 HD 型攝像頭下拍照。

總RNA 的提取以及cDNA制備 免疫7 d和14 d后，各組實驗魚分別取適量的頭腎、中腎、腸道和脾臟組織，按Trizol法提取總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性，用微量分光光度計測定RNA 樣品的濃度。再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit說明書將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于熒光定量PCR擴增模板。

實時熒光定量PCR引物設(shè)計 在NCBI 上查找草魚β-actin、IgM和MHCⅠ的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 β-actin、IgM和MHCⅠ基因引物

草魚IgM和MHCⅠ基因組織表達分析 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作模板進行實時熒光定量PCR，每個樣品3 個平行。按照熒光定量試劑盒步驟在ABI 7500 ( Applied Biosystems) 實時熒光定量PCR 儀上進行熒光定量PCR 檢測，反應體系：SYBRPremix ExTaqTM Ⅱ( 2×) 5 μL，ROX Reference Dye II(50×) 0.2 μL，10 μmol /L 的上下游引物各0.2 μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.4 μL，反應總體積為10 μL。反應條件:95 ℃ 預變性30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，擴增40 個循環(huán)， 60 ℃延伸時采集熒光信號，反應結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行溶解曲線分析，以確保特異性擴增。采用2- ΔΔCt法計算樣品中IgM和MHCⅠ基因mRNA 的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 組織學觀察

2.1.1 頭腎的觀察

壓塘3月齡草魚頭腎中可觀察到分化明顯且不規(guī)則分布的粒細胞和大量淋巴細胞，同時還能觀察到相間分布的微靜脈和血竇。淋巴細胞不規(guī)則分布，仍有腎小管結(jié)構(gòu)(見圖版Ⅰ-1)。普通3月齡草魚頭腎中未見腎小管，頭腎實質(zhì)中無腎單位，淋巴細胞有聚集分布現(xiàn)象，可觀察到動脈、靜脈和豐富的血竇，竇腔較大，內(nèi)含大量血細胞，靜脈與竇腔相通。頭腎中還分散有腎上腺細胞群。此時的頭腎區(qū)域間界限明顯，可觀察到淋巴細胞聚集區(qū)和腎上腺內(nèi)分泌組織區(qū)(見圖版Ⅰ-2)。

2.1.2 中腎的觀察

壓塘3月齡草魚中腎可觀察到腎小管間有淋巴組織分布，這些淋巴組織主要由淋巴細胞、黑色素巨噬細胞、紅細胞和各種粒細胞組成。可識別出近端小管與遠端小管。近端小管長且彎曲，管壁細胞排列緊密，細胞核呈柱狀或梭形，強嗜堿性，管腔內(nèi)有濃密的嗜酸性刷狀緣，對管腔有閉鎖作用；遠端管多呈圓形，管壁細胞排列緊密，細胞核呈橢圓形，嗜堿性，管腔內(nèi)光滑無刷狀緣(見圖版Ⅰ-3)。普通3月齡草魚的中腎可觀察到大量的淋巴組織與腎小管相間分布，這些淋巴組織中已可分辨出大淋巴細胞和小淋巴細胞。同時黑色素巨噬細胞、紅細胞和各種粒細胞數(shù)量也較多，腎小管管徑已明顯擴大，管壁細胞的核質(zhì)比已顯著減小，細胞質(zhì)嗜酸性明顯。近端小管與遠端小管管腔也有擴大，近端小管管腔內(nèi)刷狀緣對管腔的閉鎖程度較壓塘3月齡草魚近端小管小，為亞成熟腎小管。此時，部分腎單位開始出現(xiàn)和成體相同的細胞形態(tài)。未見腎小球(見圖版Ⅰ-4)。

2.1.3 腸道的觀察

壓塘3月齡草魚腸腔內(nèi)黏膜褶高約占腸腔半徑的1/2，排列不緊密;腸腔內(nèi)黏膜層較薄，由單層柱狀上皮細胞和杯狀細胞組成，上皮細胞間有H.E深染為紫藍色的黏液細胞分布，細胞核橢圓形，中位或基位；黏膜下層由比較疏松的結(jié)締組織組成;外被平滑肌構(gòu)成的肌肉層。腸道固有層中含有大量的粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞，沿黏膜褶彎曲方向聚集(見圖版Ⅰ-5)。普通3月齡草魚腸腔內(nèi)黏膜皺褶豐富，腔內(nèi)黏膜層變厚，腸上皮為單層柱狀上皮，細胞高柱狀，上皮細胞間有黏液細胞，高柱狀的上皮細胞游離面有密集排列的微絨毛組成的紋狀緣。腸道黏膜組織中的粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞數(shù)量進一步增加，散布于黏膜褶中(見圖版Ⅰ-6)。

2.1.4 脾臟的觀察

壓塘3月齡草魚脾臟有集中分布在中部的黑色素巨噬細胞中心結(jié)構(gòu)，血管橫跨整個脾臟，位于脾臟的中央，管外有大量嗜堿性細胞分布。微血管發(fā)達，有大量紅細胞、淋巴細胞和粒細胞相間分布，還可觀察到少量巨噬細胞結(jié)構(gòu)(見圖版Ⅰ-7)。普通3月齡草魚脾臟中部分黑色素巨噬細胞中心結(jié)構(gòu)已經(jīng)擴大區(qū)域，約比壓塘3月齡的大一倍，脾臟主要由淋巴組織組成，分白髓、紅髓2 個主要部分。紅髓和白髓混合排列，兩者無明顯界限。白髓主要由較為密集的淋巴細胞組成；紅髓由血細胞含量較多的脾索及大小形狀不規(guī)則的脾竇組成(見圖版Ⅰ-8)。

圖1 各時期IgM與MHCⅠ在不同組織中的相對表達量

壓塘3月齡草魚免疫7 d后IgM(a)和MHCⅠ(b)在各組織中的表達量；壓塘3月齡草魚免疫14 d后IgM(c)和MHCⅠ(d)在各組織中的表達量；普通3月齡草魚免疫7 d后IgM(e)和MHCⅠ(f)在各組織中的表達量；普通3月齡草魚免疫14 d后IgM(g)和MHCⅠ(h)在各組織中的表達量(“*”表示差異顯著，“**”表示差異極顯著)

圖2 不同時期各組織中IgM與MHCⅠ的相對表達量

i.不同時期各組織IgM相對表達量;j.不同時期各組織MHCⅠ相對表達量(Ⅰ7代表壓塘3月齡草魚免疫7 d后，Ⅰ14代表壓塘3月齡草魚免疫14 d后，Ⅲ7代表普通3月齡草魚免疫7 d后，Ⅲ14代表普通3月齡草魚免疫14 d后)

2.2 草魚IgM、MHCⅠ 基因的相對表達量

免疫后IgM與MHCⅠ的相對表達量峰值均出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中(IgM為74.51倍(P<0.01)，MHCⅠ為56.02倍(P<0.01))。壓塘3月齡草魚在免疫7 d后，注射組的IgM和MHCⅠ在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的表達量均高于對照組。免疫14 d后，注射組IgM的相對表達量在中腎中顯著高于對照組(1.48倍，P<0.05)，在頭腎、腸道和脾臟中的相對表達量均低于對照組，但P值大于0.05不具統(tǒng)計學意義；注射組MHCⅠ在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達量均高于對照組。普通3月齡草魚在免疫7 d后，注射組的IgM在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達量均高于對照組;注射組MHCⅠ的相對表達量在頭腎、中腎和脾臟中均高于對照組，在腸道中的相對表達量低于對照組。免疫14 d后，注射組IgM的相對表達量在頭腎、中腎、腸道和脾臟中均高于對照組，注射組MHCⅠ在頭腎、中腎和脾臟中的相對表達量均高于對照組，在腸道中的相對表達量低于對照組(圖1、圖2)。

3 討論

本研究對壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟進行了組織學觀察，結(jié)果顯示壓塘3月齡草魚頭腎中仍有腎小管結(jié)構(gòu)，處于混合型腎臟及分泌組織階段；普通3月齡草魚頭腎中有大量淋巴細胞分布，未見腎小管，此結(jié)果與雷雪彬等[8]的發(fā)現(xiàn)一致。岳興建等[9]在南方鲇上發(fā)現(xiàn)3月齡時，部分腎單位出現(xiàn)和成體相同的細胞形態(tài)。貝氏高原鰍中腎基本發(fā)育成熟是在出膜后80～135 d[10]。該實驗觀察到的壓塘3月齡草魚中腎單位多處于亞成熟狀態(tài)；普通3月齡草魚中腎已開始出現(xiàn)與成體相同的細胞形態(tài)。腸道是魚類主要的消化器官和內(nèi)分泌器官，同時也是最大的黏膜組織。壓塘3月齡草魚腸道中可觀察到大量粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞；普通3月齡草魚腸道粘膜組織中觀察到的免疫相關(guān)細胞數(shù)量進一步增加，有研究[11-13]表明，黏膜組織中的粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞能接受外界抗原的刺激，引起局部免疫反應，在機體的免疫中起著重要的作用，這些可以有效誘發(fā)參與免疫應答的淋巴細胞主要在中后腸分布[14]。壓塘3月齡草魚脾臟沒有分化為明顯的紅髓和白髓，有大量淋巴細胞和粒細胞分散在紅細胞之間，具有一定免疫功能；普通3月齡草魚脾臟中黑色素巨噬細胞中心結(jié)構(gòu)團面積較大，有界限不明的紅髓和白髓混合排列，此時脾臟具成熟的組織結(jié)構(gòu)。組織學結(jié)果分析顯示：壓塘3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟發(fā)育遲緩，處于未成熟狀態(tài)；普通3月齡草魚的頭腎、中腎、腸道和脾臟功能已趨于成熟。

IgM 是B淋巴細胞最早產(chǎn)生的免疫球蛋白，也是B 淋巴細胞分化過程中的主要表面標志[15]同時也是體液免疫最重要的指標之一，它可以中和血液循環(huán)中的病原[16]，或捕獲脾邊緣區(qū)的病原體，并增強抗原的免疫原性，以及對B 細胞進行增強活化[17]。目前，已有多種疫苗被證明能夠顯著性提高魚體的IgM ，并使魚體產(chǎn)生保護性免疫反應[7]。主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)能夠識別、清除外來和內(nèi)在抗原，在免疫學上具有極為重要的意義[18]。魚類MHC主要包括MHCⅠ類和MHCⅡ類基因，其中MHCⅠ類分子主要參與內(nèi)源性抗原的遞呈[19]。本實驗對這兩個時期的草魚進行草魚出血病活疫苗(GCHV-892株) 腹腔注射，通過實時熒光定量PCR檢測了IgM與MHCⅠ在免疫7 d與14 d后的頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達量。IgM與MHCⅠ的相對表達量峰值出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中。普通3月齡草魚免疫后頭腎、中腎和脾臟中IgM的相對表達量均明顯高于壓塘3月齡草魚，但在腸道中的表達量差異不明顯，推測可能與本實驗采用的注射免疫方式有關(guān)。Strand等[20]認為，腸道后半部分的上皮細胞可以通過內(nèi)吞方式攝取并轉(zhuǎn)移大分子抗原，轉(zhuǎn)送到腸道固有層的巨嗜細胞和血液循環(huán)系統(tǒng)中。故口服免疫方式可能對腸道中IgM作用更明顯，但具體影響機制還有待進一步探討。壓塘3月齡草魚免疫后的兩周時間內(nèi)，MHCⅠ除在頭腎中的相對表達量增幅變大，中腎、腸道和脾臟中的MHCⅠ相對表達量的增幅都有所下降。而普通3月齡草魚在免疫后的兩周時間內(nèi)，各組織中的MHCⅠ相對表達量的增幅都有升高。故接種疫苗后，正常養(yǎng)殖的普通魚能夠比高密低投的壓塘魚更好地引起相關(guān)因子有效的免疫應答。宋曉青等[21]在針對牙鲆的研究中發(fā)現(xiàn)，草魚和牙鲆在免疫后其脾臟和頭腎中MHCⅠ都上調(diào)表達。奕志娟等[22]發(fā)現(xiàn)不同劑量的疫苗對脾臟中MHCⅠmRNA表達的影響均為先上調(diào)后下降的趨勢，與本實驗結(jié)果相似。其可能的應答機制為免疫細胞廣泛存在的模式識別受體信號通路逐級傳遞抗原信息，迅速引起相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄[21]，說明疫苗免疫增強了機體呈遞抗原的能力。

葉華等[23]根據(jù)齊口裂腹魚較強細胞免疫出現(xiàn)的時間段，建議在齊口裂腹魚養(yǎng)殖過程中，在由嗜水氣單胞菌引起的疾病流行爆發(fā)季節(jié)到來之前的7～14 d，進行滅活菌苗注射以增強免疫力。蘇友祿等[24]認為在免疫系統(tǒng)發(fā)育完善前注射疫苗會引起對此種抗原的耐受，因而其建議針對軍曹魚系統(tǒng)免疫的疫苗接種時間不應在24 dph以前，又或許在44 dph后接種疫苗效果更好。本實驗在組織結(jié)構(gòu)和免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)都支持草魚在正常發(fā)育3月齡時期免疫效果更好，而壓塘3月齡草魚由于各免疫器官發(fā)育尚未成熟，免疫效果不佳。綜上所述，本研究觀察了壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚部分免疫器官組織的顯微結(jié)構(gòu)，并觀察了草魚出血病減毒活疫苗免疫注射后，草魚主要免疫相關(guān)基因IgM與MHCⅠ的表達水平，發(fā)現(xiàn)在草魚免疫組織結(jié)構(gòu)發(fā)育完善的正常養(yǎng)殖3月齡時期進行疫苗注射免疫效果更好，而壓塘3月齡草魚由于養(yǎng)殖密度過大，投喂飼料不足等問題生長發(fā)育遲緩，免疫效果不佳。本研究結(jié)果為生產(chǎn)實踐提供了科學可靠的基礎(chǔ)資料，對草魚出血病的免疫防治具有重要的實踐指導意義。

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(責任編輯：張紅林)

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ISSN 1001-1994 CN 31-1250

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《水產(chǎn)科技情報》是由上海市水產(chǎn)研究所、上海市水產(chǎn)學會主辦的水產(chǎn)技術(shù)類雜志，被《中文核心期刊要目總覽》(1992、2004、2008、2011年版)收錄，是中國期刊方陣雙效期刊、華東地區(qū)優(yōu)秀期刊、上海市優(yōu)秀科技期刊。本刊堅持“以技術(shù)性為主，兼容學術(shù)性、普及性和動態(tài)、信息性”的辦刊方針以及“立足上海、服務全國、面向市場，積極參與國際間漁業(yè)科技和信息交流”的辦刊目標，注重學科的前瞻性，技術(shù)的先進性，動態(tài)信息的及時性，市場的導向性以及文字的可讀性，把普及與提高結(jié)合起來，較好地適應了水產(chǎn)界多層次讀者的需求，發(fā)行面遍及全國(包括港臺地區(qū))，并涉足東南亞地區(qū)。主要欄目：綜述、海水養(yǎng)殖、淡水養(yǎng)殖、水產(chǎn)飼料、病害防治、漁業(yè)環(huán)境、專題講座(以特種水產(chǎn)養(yǎng)殖為主)、觀賞魚和水族生態(tài)、漁業(yè)簡訊等。本刊為雙月刊，逢單月20號出版，國際標準大16開。讀者可向當?shù)剜]局辦理訂閱手續(xù)，也可直接匯款至編輯部訂閱。歡迎來電來函垂詢。本刊承接各類漁業(yè)商品廣告，封頁涂塑，彩版采用進口銅版紙印刷，并有彩色、雙色、單色插頁，設(shè)計獨到，制作精良，收費合理，歡迎廣大廠商惠顧。

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圖版Ⅰ 草魚不同時期各組織的顯微觀察

1.壓塘3月齡草魚頭腎，標尺:200 μm。2.普通3月齡草魚頭腎，標尺:50 μm。3.壓塘3月齡草魚中腎，標尺:200 μm。4.普通3月齡草魚中腎,標尺:200 μm。5.壓塘3月齡草魚腸道，標尺:50 μm。6.普通3月齡草魚腸道，標尺:50 μm。7.壓塘3月齡草魚脾臟，標尺:200 μm。8.普通3月齡草魚脾臟，標尺:200 μm。

C.PD 腎小管；P 近端小管；DS 遠端小管；MU 中腎單位；MC 肌層；MF 黏膜皺襞。)

The histology of immune organs of 3-month-old grass carp and transcriptional differences of immune genes after immunization

ZHANG Peng-ying1,2,CHANG Ou-qin1,SHI Cun-bin1,WU Shu-qin1

(1.KeyLabofAquaticAnimalImmuneTechnologyofGuangdongProvince,KeyLabofFisheryDrugDevelopmentofMinistryofAgriculture/PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

In order to study the consistency between the degree of maturation and the body sizes of the grass carpCtenopharyngodonidellusin different breeding conditions,the experiment observed the microstructure of head kidney,kidney,intestine and spleen in high-density and low-feeding 3-month-old grass carp and common 3-month-old grass carp,and intraperitoneal injection of vaccine treatment was conducted in the two groups of grass carp.Head kidneys,kidneys,intestines and spleens were sampled on days 7 and 14 days after injection,and the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs were detected through the real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR).The results showed that the development of different organs was slow in high-density,low-feeding 3-month-old grass carp,and the head kidneys,kidneys,intestines and spleens of common 3-month-old grass carp almost attained maturity.After immunization,the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs of high-density,low-feeding 3-month-old grass carp were significantly increased.The highest expression of IgM and MHCⅠ appeared in the kidney of common 3-month-old grass carp immunized 14 days (IgM for 74.51 times,MHC class Ⅰ for 56.02 times).Results showed that grass carp hemorrhage live vaccine can enhance the expression of IgM and MHCⅠ in head kidney,kidney,intestine and spleen of grass carp,and the age of 3 months period were the best immunization time.

grass carp;histology of immune organs;vaccine immunization;IgM;MHCⅠ

2016-04-13；

2016-05-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金“大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”(CARS-46)；“十二五”國家科技支撐計劃：淡水養(yǎng)殖魚類病害免疫防控關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)(2012BAD25B00)

張鵬英(1989- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向為水產(chǎn)動物疾病防治。E-mail:504937622@qq.com

吳淑勤。E-mail:wushuqin001@21cn.com；常藕琴，E-mail:changouqin@163.com

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