王菊華，張國華，黃江麗，黃 黃，圣 平，張志紅

(江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330096)

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甲殼素發(fā)酵液在彭澤鯽幼魚養(yǎng)殖上應(yīng)用效果

王菊華，張國華，黃江麗，黃 黃，圣 平，張志紅

(江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330096)

為研究甲殼素發(fā)酵液(Chitin fermentation liquid，CFL)在彭澤鯽(Carassiusauratusvariety pengze)幼魚上效果，通過在室外養(yǎng)殖池水體中定期潑灑CFL，比較不同用量CFL(0.01%和0.02%)以及0.02%CFL和商品殼聚糖(Chitosan，C)聯(lián)合應(yīng)用效果，每個處理3次重復(fù)。飼養(yǎng)初始彭澤鯽體重為35 g左右，培養(yǎng)2個月后測定幼魚生長性能和水體指標。結(jié)果顯示：0.01% CFL、0.02 % CFL和0.02% CFL+C三個處理彭澤鯽總體重與養(yǎng)殖初期比較增重均達到20%以上，增重效果分別比對照高101.5%、110.4%和172.7%。0.01% CFL和0.02% CFL處理的彭澤鯽消化系統(tǒng)中脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶比對照高22.03%以上，但兩個濃度之間差異不顯著。CFL處理降低養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、總氮和總磷含量，0.01% CFL處理分別比對照低29.4%、15.2%和77.8%，其它兩個處理與0.01% CFL差異不顯著。CFL處理降低了感染嗜水氣單胞菌后彭澤鯽的死亡率，提高了保護效果。結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液明顯提高彭澤鯽抗病能力，促進魚體生長，改善水質(zhì)。

甲殼素發(fā)酵液；殼聚糖；彭澤鯽(Carassiusauratusvariety pengze)；嗜水氣單胞菌

在漁業(yè)養(yǎng)殖逐漸實現(xiàn)集約化和工廠化過程中，魚類非常容易感染病原微生物，病害頻繁發(fā)生。大量抗生素和農(nóng)藥長期使用不僅使魚肉的品質(zhì)受到嚴重的影響，并且藥品的長期使用還會通過食物鏈直接影響人類健康[1]。因此，有必要開發(fā)綠色環(huán)保和價廉的漁業(yè)養(yǎng)殖專用產(chǎn)品。甲殼素(Chitin)是自然界中合成量僅次于纖維素的第二大可再生自然資源，大量存在于節(jié)肢動物如蝦、蟹和昆蟲外殼中，也存在于菌類、藻類和高等植物的細胞壁中，分布極其廣泛，是保健食品、醫(yī)用材料以及化妝品行業(yè)重要原料[2]。甲殼素化學(xué)特性穩(wěn)定，不易分解和熔化，不溶于水、乙醇、乙醚、稀酸(但溶于乙酸)和稀堿。甲殼素的不溶性限制了其應(yīng)用范圍，所以大多加工成衍生物殼聚糖使用。殼聚糖(Chitosan)又稱為脫乙酰甲殼質(zhì)、可溶性甲殼素、甲殼胺等，是由甲殼素脫乙?；笊傻闹辨湺嗵?。近年來國內(nèi)外對其應(yīng)用研究十分活躍，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一種堿性多糖，具有良好的生理活性和生物相容性[3]。甲殼素衍生物作為飼料添加劑在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上應(yīng)用，具有調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)代謝、促進生長、增強抗氧化能力和提高抗病和免疫能力等作用，可部分替代抗生素等化學(xué)藥物[4-6]。本試驗選用課題組研制的甲殼素微生物發(fā)酵液，研究其在彭澤鯽(Carassiusauratusvariety pengze)上的養(yǎng)殖效果，比較不同濃度甲殼素發(fā)酵液對彭澤鯽生長性能、抗病能力和水質(zhì)環(huán)境的影響，為提高漁業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)、開發(fā)新產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

魚苗：購自江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，選取體重35 g左右彭澤鯽。

飼料：市場購買，主要成分含量為粗蛋白28.0%，粗脂肪8.5%，總磷0.60%，粗纖維10.0%，粗灰分11.0%，水份13.0%。

病原菌：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，上海海洋大學(xué)贈送。

甲殼素發(fā)酵液(CFL)：本課題組開發(fā)的一種微生態(tài)制劑，該制劑是由三種芽孢桿菌(Bacillussp.)和一種酵母菌(Saccharomycessp.)聯(lián)合降解膠質(zhì)甲殼素得到的發(fā)酵液，發(fā)酵后甲殼素降解為殼聚糖。發(fā)酵液中含有大量脫乙酰酶和幾丁質(zhì)酶，四種微生物總含量=10×108個/mL。

商品殼聚糖(C)：粉狀制品，購于山東青島海良生物制品有限公司，脫乙酰度為99%。

1.2 試驗方法

試驗設(shè)4個處理：①對照(CK)，僅飼喂基礎(chǔ)飼料；②0.01%甲殼素發(fā)酵液(0.01% CFL)，按照池水量0.01%投入，每隔7 d潑灑一次；③0.02%甲殼素發(fā)酵液(0.02% CFL)，按照池水量0.02%投入，每隔7 d潑灑一次；④0.02%甲殼素發(fā)酵液+殼聚糖(0.02% CFL+C)，殼聚糖在基礎(chǔ)飼料中按照0.1%添加，甲殼素發(fā)酵液按照池水量0.02%投入，每隔7 d潑灑一次。每個水泥養(yǎng)殖池為1個重復(fù)，每個處理設(shè)3個重復(fù)。室外水泥養(yǎng)殖池的水體面積為6 m2，水深0.5 m，養(yǎng)殖水直接取自無污染的地下水，加水靜置7 d 后再放魚養(yǎng)殖。

選擇健壯、無傷病、體長和體重接近的幼魚，試驗開始前對幼魚稱重，每個水池中彭澤鯽40 尾。日投喂量按體重的3%飼喂，每天2 次，上下午各1 次。先用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)7 d，至攝食正常后，開始正式試驗。在整個試驗過程中，池水日通氣時間不少于10 h，養(yǎng)殖過程中不換水。養(yǎng)殖時間為9月25日—11月25日，養(yǎng)殖結(jié)束幼魚稱重。

攻毒試驗：每個水池中選出20 尾彭澤鯽進行攻毒試驗。試驗在室內(nèi)可控溫、通氣玻璃魚缸內(nèi)進行，溫度控制在25 ℃左右。嗜水氣單胞菌在接種之前活化3次，經(jīng)預(yù)試驗確定攻毒濃度為4×107個/mL，注射劑量為每尾魚0.1 mL，采用腹腔注射方法。每天記錄攻毒后彭澤鯽的累積死亡數(shù)。按下式計算各組相對保護率(relative percent survival，RPS)。

RPS=(1-處理死亡率/對照死亡率)×100%

水質(zhì)測定：不同時間取樣測定養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、總氮和總磷含量，亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，總磷采用鉬酸銨分光光度法[7]。

消化酶測定：養(yǎng)殖試驗結(jié)束后取饑餓1 d的彭澤鯽，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定魚體內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。從每個處理組中隨機取彭澤鯽6 尾，取出全腸和肝胰臟，將全腸和肝胰臟一起稱重，置于勻漿器中，加入10倍體積的高純水勻漿，在4 ℃冰箱中靜置過夜。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，獲得的上清液即為粗酶液，并置于4 ℃冰箱中待用[8]。脂肪酶活性測定以37 ℃條件下每g組織蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1個酶活力單位。蛋白酶活性測定以每mg組織蛋白37 ℃每min水解生成1 μg氨基酸作為1個酶活力單位。淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法，以組織中每mg蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS V8軟件的Duncan氏法進行多重比較，P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對幼魚生長和抗病的影響

甲殼素發(fā)酵液處理對彭澤鯽幼魚促進生長效果明顯(見表1)，每個處理中彭澤鯽總體重與養(yǎng)殖初期比較增重均達到20%以上，三個處理分別比對照增重高101.5%、110.4%和172.7%，增重效果顯著高于對照。比較甲殼素發(fā)酵液與殼聚糖聯(lián)合處理效果，對彭澤鯽促生效果比單獨甲殼素發(fā)酵液效果更好。在試驗過程中，彭澤鯽感染了存活在養(yǎng)殖水泥池中的寄生蟲——小瓜蟲，對照在15 d時全部死亡，甲殼素發(fā)酵液處理比對照晚5 d出現(xiàn)小瓜蟲感染癥狀，死亡率為50%左右。由于試驗中彭澤鯽感染寄生蟲，先前一批養(yǎng)殖20 d時清除剩余彭澤鯽，養(yǎng)殖池用石灰水徹底消毒、曝曬后重新開始試驗。

表1 不同處理對彭澤鯽總體重的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

養(yǎng)殖60 d后嗜水氣單胞菌病原菌對不同處理彭澤鯽攻毒，結(jié)果表明(見表2)，10 d時甲殼素發(fā)酵液都能有效降低彭澤鯽幼魚死亡率，相對保護率均達到58%以上。

2.2 不同處理對彭澤鯽幼魚消化酶活力的影響

從消化系統(tǒng)中三種消化酶測定結(jié)果看(見表3)，甲殼素發(fā)酵液處理提高了彭澤鯽幼魚體內(nèi)消化酶活性。0.01%甲殼素發(fā)酵液處理彭澤鯽脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶分別比對照高26.13%、25.60%和36.41%，0.02%分別比對照高35.11%、22.03%和43.09%，0.01%和0.02%甲殼素發(fā)酵液差異不明顯。甲殼素發(fā)酵液與殼聚糖聯(lián)合效果對三種消化酶提高效果更明顯，提高幅度都達到45%以上。

表2 嗜水氣單胞菌攻毒后第10天彭澤鯽幼魚死亡情況

表3 不同處理對彭澤鯽體內(nèi)消化酶影響

2.3 不同處理對彭澤鯽養(yǎng)殖水質(zhì)因素的影響

從表4可以看出不同處理對養(yǎng)殖水質(zhì)因素的影響，甲殼素發(fā)酵液處理均能不同程度降低亞硝態(tài)氮、總氮和總磷含量，0.01%甲殼素發(fā)酵液處理分別比對照相應(yīng)低29.4%、15.2%和77.8%(P<0.05)，0.02%甲殼素發(fā)酵液處理分別低32.1%、19.0%和77.8%，0.02%甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖聯(lián)合處理分別低27.8%、13.3%和86.9%。從結(jié)果看出，0.02%甲殼素發(fā)酵液對三種水體環(huán)境因子降低效果略好于0.01%甲殼素發(fā)酵液處理，但是沒有達到顯著性差異；0.02%甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖聯(lián)合處理與單獨0.02%甲殼素發(fā)酵液比較效果不明顯。

3 討論

甲殼素脫乙酰降解為殼聚糖需要大量氫氧化鈉、正戊醇、過氧化氫等化學(xué)試劑，反應(yīng)過程需要高溫和多次洗滌脫堿等，并且能耗高、環(huán)境污染嚴重。因此，用化學(xué)方法制備殼聚糖越來越受到限制[9]。利用微生物及其產(chǎn)生酶降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖，產(chǎn)物豐富，含有不同鏈長度的殼聚糖以及其他活性物質(zhì)，關(guān)鍵是環(huán)境污染少，成本低，是一種很有研究和應(yīng)用價值的殼聚糖生產(chǎn)方法[10]。本研究采用四種微生物聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)方法，利用微生物產(chǎn)生的脫乙酰酶和幾丁質(zhì)酶降解膠質(zhì)甲殼素，發(fā)酵

表4 不同處理對養(yǎng)殖水體參數(shù)的影響

后含有不同降解程度的殼聚糖以及大量微生物。因此，甲殼素發(fā)酵液是一個多元復(fù)合產(chǎn)品，不同于結(jié)構(gòu)單一的商品殼聚糖。

于東祥等[11]在真鯛(Pagrosomusmajor) 幼魚試驗中比較了殼聚糖與腐植酸鈉、海藻酸鈉等不同添加劑對幼魚生長影響，殼聚糖處理比對照增重高28.03%，增重效果好于其它添加劑。任秀芳等[12]在基礎(chǔ)飼料中添加不同比例殼聚糖研究對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)存活和免疫功能等影響，結(jié)果表明殼聚糖明顯提高克氏原螯蝦的生長性能和非特異性免疫。華雪銘等[8]研究殼聚糖對水產(chǎn)動物促生作用主要表現(xiàn)為提高消化酶活性，腸道消化酶活性的提高是促進魚體生長的重要原因之一。甲殼素及其衍生物通過提高魚體的消化酶活性來提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進而提高對蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[13]，本研究甲殼素發(fā)酵液明顯促進彭澤鯽幼魚體內(nèi)消化酶活性，是促進魚體生長的重要因素之一。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有益菌廣泛作為飼料添加劑來調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，促進機體生長[14]。芽孢桿菌明顯提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)、羅非魚(Oreochromisniloticus)和黑鯛(Sparusmacrocephlus)等水生動物生長性能[15-17]，芽孢桿菌通過定殖在腸道后刺激腸道內(nèi)壁，增加內(nèi)源性消化酶的分泌和活性的增強，提高消化吸收能力，保證機體快速生長[18]。同時，芽孢桿菌作為外源菌能抑制腸道有害菌繁殖，平衡腸道菌群，促進腸道中有益菌群乳酸桿菌(Lactobacillussp.)和雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)繁殖，增強該系統(tǒng)的穩(wěn)定性和自身調(diào)節(jié)能力，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高機體免疫能力[19]。本研究中甲殼素發(fā)酵液含有的芽孢桿菌和酵母菌對彭澤鯽生長可能也發(fā)揮重要作用。甲殼素發(fā)酵液不僅促進幼魚生長，也提高彭澤鯽幼魚對病原菌嗜水氣單胞菌和寄生蟲小瓜蟲的抗性，相對保護率明顯高于對照。本研究中，甲殼素發(fā)酵液與殼聚糖聯(lián)合處理效果明顯高于單獨0.02%甲殼素發(fā)酵液處理，說明添加商品殼聚糖能進一步提高甲殼素發(fā)酵液應(yīng)用效果，可能與它們有效成分含量和結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

水質(zhì)環(huán)境好壞是養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，在養(yǎng)殖過程中各種殘餌和排泄物影響水質(zhì)，引起水產(chǎn)動物死亡[20]。任秀芳等[21]在水體中添加不同濃度羧化殼聚糖，結(jié)果表明殼聚糖顯著降低水體中氨態(tài)氮、硫化氫、亞硝酸鹽的濃度、改善水質(zhì)和穩(wěn)定水體pH值。孫艷輝等[22]也研究了殼聚糖對亞硝酸鹽的清除作用，隨殼聚糖用量增加對亞硝酸鹽清除能力也升高。李永芹等[23]研究表明，芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽的降解率分別為81.9%和64.3%，對凈化養(yǎng)殖池塘水質(zhì)有明顯作用。張峰峰等[24]研究認為芽孢桿菌可迅速有效降低水體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量，4 d去除率均達99%以上，可有效降低水體pH值，但對氨氮沒有明顯作用。周建忠等[25]在研究微生物與酶效果時也發(fā)現(xiàn)隨著用量增加，試驗組降低底泥中有機碳效果并無顯著性差異，考慮經(jīng)濟效益問題，建議采用較低劑量。孫逢明[26]研究7個用量的側(cè)芽孢桿菌對水質(zhì)改善效果，亞硝態(tài)氮和氨態(tài)氮降解效果沒有隨用量提高而提高。微生態(tài)制劑使用量控制在一定范圍內(nèi)才能有效提高水產(chǎn)動物生長，否則適得其反，降低動物生長性能[27]。桂琳等[28]研究復(fù)合益生菌不同用量對草魚影響發(fā)現(xiàn)，當添加量為3 000 mg /kg時，增重率和超氧化物歧化酶活性低于添加量為2 000 mg/kg。本研究中，甲殼素發(fā)酵液對水質(zhì)環(huán)境改善，應(yīng)該與發(fā)酵液中含有的殼聚糖和有益微生物密切相關(guān)。0.01%和0.02%甲殼素發(fā)酵液對水體改善和彭澤鯽生長效果接近，原因可能是養(yǎng)殖池空間相對較小、沒有外源水體交換的養(yǎng)殖環(huán)境中，微生物達到一定數(shù)量后，效果不會隨著用量增加而增加，甲殼素發(fā)酵液用量建議為0.01%。

結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液明顯提高了彭澤鯽生長速度，增強了魚體對嗜水氣單胞菌抗性，降低了水體中亞硝態(tài)氮、總氮和總磷含量，改善了水質(zhì)。

致謝

感謝江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所章海鑫等同志對本研究給予的指導(dǎo)和幫助。

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(責(zé)任編輯：陳細華)

Effects of chitin fermentation liquid on Carassius auratus variety pengze

WANG Ju-hua,ZHANG Guo-hua,HUANG Jiang-li,HUANG Huang, SHENG Ping，ZHANG Zhi-hong

(InstituteofBiologicalResourceofJiangxiAcademyofSciences,Nanchang330096,China)

The effects of the Chitin Fermentation Liquid (CFL) onCarassiusauratusvariety pengze were determined under different concentrations of CFL and CFL-plus- commercial chitosan(0.02% CFL+C),and CFL were splashed into the water regularly.The present results showed that fish weights increased by more than 20% at the end of 2 months of 0.01% CFL,0.02% CFL and 0.02% CFL+C treatments.The growth rates of fishes in these three treatment groups were 101.5%,110.4% and 172.7% higher than that of the control group,respectively (P<0.05).The lipase,trypsin and amylase activities in digestive tracts of fishes treated by 0.01% and 0.02% CFL were 22.03% higher than those of the control group,and there was no significant difference between the 0.01% CFL and 0.02% CFL treatments (P>0.05).In the 0.02% CFL+C treatment group,these three enzyme activities of fishes were 45% higher than those of the control group (P<0.05).Furthmore,we also found that,in the 0.01% CFL treatment group,the nitrite nitrogen,total nitrogen and total phosphorus contents of water were 29.4%,15.2% and 77.8 % lower than those of the control group,respectively (P<0.05).There was no significant difference between 0.01% CFL treatment group and the other two treatment groups (P>0.05).Besides ,the CFL treatment could also reduce the mortality rate of fishes infected byAeromonashydrophila.Taken together,the CFL could improve the disease resistance,growth rate of the fish and water quality.The results presented here clearly indicated the potential of CFL as microbiological preparation for aquaculture.

Chitin fermentation liquid (CFL);chitosan;Carassiusauratusvariety pengze;Aeromonashydrophila

2016-01-06；

2016-06-24

江西省科技攻關(guān)計劃(20111BBF60043) ；江西省科學(xué)院國家預(yù)研項目(2013-YGY-6)

王菊華(1961- ) ，男，副研究員，主要從事魚病防治研究。E-mail：190943152@qq.com

張志紅。E-mail：zzh04scau@126.com

S963.73

A

1000-6907-(2016)06-0104-05