王 磊，陳再忠，冷向軍，高建忠，劉 穎，劉漢鵬，宋雪露

(上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海 201306)

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飼料中添加雨生紅球藻對七彩神仙魚生長、體色及抗氧化力的影響

王 磊，陳再忠，冷向軍，高建忠，劉 穎，劉漢鵬，宋雪露

(上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海 201306)

為探討雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)對七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)增色效果以及對機體抗氧化力的影響，分別用添加0(對照組)、3.33、6.66、9.99、13.32和16.65 g/kg雨生紅球藻(折算成蝦青素添加量分別為0、100、200、300、400和500 mg/kg飼料)的飼料飼喂七彩神仙魚6周，測定七彩神仙魚皮膚、鰭條、肌肉和肝臟中的蝦青素含量、體表的三刺激值和肝臟總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)含量。結果顯示：飼料中添加雨生紅球藻可以顯著提高七彩神仙魚的增重率，當添加量為9.99 g/kg其增重率最大。七彩神仙魚皮膚、鰭條、肌肉和肝臟蝦青素含量隨著雨生紅球藻添加量的增加而升高，當雨生紅球藻添加量超過6.66 g/kg，各組織中蝦青素的含量趨于穩(wěn)定。隨著雨生紅球藻添加量增加，皮膚L*值(亮度)下降、而a*值(紅度)和b*值(黃度)升高，皮膚中蝦青素含量與三刺激值間的相關性均達到高度相關，并與a*值的相關性最高。隨著雨生紅球藻添加量的增加，七彩神仙魚肝臟的T-AOC和GSH的含量也逐漸升高。結果表明，在飼料中添加雨生紅球藻可提高七彩神仙魚的增重率，提高七彩神仙魚皮膚蝦青素含量，改善七彩神仙魚體色，增強機體的抗氧化能力；雨生紅球藻的添加量建議為6.66～9.99 g/kg(蝦青素含量為200～300 mg/kg)。

七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)；雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)；蝦青素； 三刺激值；抗氧化力

七彩神仙魚屬于慈鯛科(Cichlidae)盤麗魚屬(Symphysodon)，原產(chǎn)于南美亞馬遜河流域，共包括3個種，分別是黑格爾七彩神仙(S.discus)、綠七彩神仙(S.aequifasciatus)和藍棕七彩神仙(S.haraldi)。自1840年被德國人發(fā)現(xiàn)之后，經(jīng)人工養(yǎng)殖和雜交選育，形成了數(shù)十個美麗品種，由于其體色鮮艷奪目，花紋變幻，被譽為熱帶魚之王。紅色系七彩神仙魚是由野生藍棕七彩神仙魚經(jīng)過長期的雜交選育種而得的人工品系，其主要特征是身體 9條棟線明顯退化，體表花紋退化甚至消失，體表色素以紅色素細胞為主，黃色素細胞次之，僅背鰭、臀鰭、尾鰭和頭部留有少量黑色素細胞，甚至近年來改良形成的紅金七彩神仙魚體表黑色素細胞基本消失[1]。

魚類自身不具備合成黑色素以外相關色素的能力，所以其遺傳特性和外源色素的性質、劑量是影響其色斑形成的主要原因。Liu等[2]報道在飼料中添加350 mg/kg的人工蝦青素對蓋子紅七彩神仙魚(體長約3 cm)具有較好的著色效果。張曉紅等[3]在飼料中添加蝦青素和螺旋藻(Spirulinapacifica)均可有效改善血鸚鵡(Cichlasomacitrinellum♀×C.synspilum♂)體色，且蝦青素的增色效果顯著強于螺旋藻，建議蝦青素的適宜添加量為500 mg/kg。李小慧等[4]研究發(fā)現(xiàn)基礎飼料中添加500 mg/kg的蝦青素，或500 mg/kg的蝦青素+20 μg/kg甲基睪酮對血鸚鵡具有較好的增色效果。Yang等[5]研究表明飼料中添加一定量的牛黃但酸鈉可以促進血鸚鵡對蝦青素的吸收，其適宜添加組合劑量為蝦青素 400 mg/kg 飼料+?；悄懰徕c添加量為1 200 mg/kg。

在實際生產(chǎn)中通常在餌料中添加紅色素來增加紅色系七彩神仙魚體表色素含量，達到商品要求。然而，由于不同來源的蝦青素結構不同，溶解度也不同，所以在增色效果等方面會產(chǎn)生不同差異。而關于天然蝦青素對魚類增色效果的研究較少。雨生紅球藻中蝦青素含量為1.5%～3.0%,被看作是天然蝦青素的“濃縮品”。雨生紅球藻所含蝦青素及其酯類的配比(約70%的單酯,25% 的雙酯及5%的單體)與水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身配比極為相似，這是通過化學合成和利用紅發(fā)夫酵母等提取的蝦青素所不具備的優(yōu)勢[6-7 ]。此外,雨生紅球藻中蝦青素的結構以3S-3′S型為主,與鮭等水產(chǎn)生物體內(nèi)蝦青素結構基本一致[8]。天然蝦青素獨特的分子結構,使其具有強大的清除氧自由基、抑制單線態(tài)氧的能力[9],是一種比β-類胡蘿卜素、維生素E 更為有效的抗氧化劑[10]。因此，本實驗以紅色系七彩神仙魚為研究對象，在飼料中添加不同含量雨生紅球藻，考察對七彩神仙魚體色及機體免疫力的影響，可為提高七彩神仙魚觀賞價值和商品價值提供理論基礎，為雨生紅球藻在觀賞魚飼料中的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗設計與實驗飼料

添加雨生紅球藻粉(Haematoccuspluvialis)(云南愛爾發(fā)生物技術有限公司出產(chǎn)，蝦青素含量為30 g/kg)0(C0)、3.33(C1)、6.66(C2)、9.99(C3)、13.32(C4)和16.65(C5) g/kg，折算成蝦青素添加量分別為0(對照組)、100、200、300、400和500 mg/kg飼料，經(jīng)檢測，各飼料組中蝦青素實際含量依次為2.63、102.21、196.47、301.19、402.47和500.87 mg/kg。各主要原料用絞肉機絞碎混合均勻，冷凍保存，基礎飼料組成見表1。

表1 牛心漢堡配方及常規(guī)營養(yǎng)組成

注：礦物元素預混料[11](mg/kg飼料):鋅，100.00；鐵，150.00；銅，3.00；錳，20.00；碘，0.80；鈷，0.10；硒，0.10；鎂，100.00。[12]維生素預混料(IU/kg飼料):維生素A，2500.00；維生D2，2400.00；維生素預混料(mg/kg 飼料)：維生素C，150；維生素E，30.00；維生素K3，10.00；維生素B1，10.00；維生素B2，20.00；維生素B5，40.00；維生素B6，10.00；維生素B7，1.00；維生素B11，5.00；維生素B12，0.02；肌醇，400.00。

1.2 實驗魚及實驗管理

實驗用七彩神仙魚來自于本觀賞魚實驗室人工繁殖，平均體重(16.74±0.65)g，實驗分為6個處理組，每處理組3個重復，每個重復選取體質健壯，外表無傷的魚20尾，共360尾。

實驗用魚飼養(yǎng)于18個自動充氣循環(huán)的水族箱中(0.57 m×0.48 m×0.35 m)；牛心漢堡冷凍狀態(tài)下切成0.3～0.5 m3的小塊，投餌量為實驗魚體重的3%～4%，以2～3min內(nèi)吃完為宜，日投喂3次(8：30，12：30，16：30)；試驗期間水溫(27±1)℃，DO>5 mg/L，pH 值為6.9～7.8。養(yǎng)殖周期為6周。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標

于實驗結束后饑餓24 h，分別稱量實驗魚體重、體長、體高，計算增重率、飼料系數(shù)和成活率，主要測定指標如下：

增重率(WG)=(末均重-初均重)(g)/初均重(g)×100%

餌料系數(shù)(FCR)=總投飼量/(末體重-初體重)

成活率(SR)=試驗末魚尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù)×100%

1.3.2 基本生化成分的測定

飼養(yǎng)實驗結束后，每缸取魚3尾，取背部肌肉于-20 ℃低溫冷凍保存。飼料和肌肉中的粗蛋白質采用凱氏定氮儀測定；水分測定采用105 ℃烘干法(GB/T 6435-2006)；粗脂肪測定采用索氏抽提法測定；灰分采用550 ℃馬弗爐灼燒法測定。

1.3.3 七彩神仙魚體表三刺激值( L*、a*、b*值) 的測定

用L*(明度)、a*(+a*偏紅，-a*偏綠)、b*(+b*偏黃 -b*偏藍)代表顏色狀態(tài)。所用色差計為上海精密科學儀器有限公司物理光學儀器廠生產(chǎn)的WSC-S型測色色差計(o/d光源，帶光澤，穩(wěn)定性ΔY≤0.6)。測定時，先用吸水紙將魚體表面的水分吸干，再將色差計的探頭緊貼于魚體側最寬處側線以上測量，并記錄L*、a*、b*值[3]。

1.3.4 蝦青素含量測定

養(yǎng)殖實驗結束后，每缸取魚3尾，取側線以上背部鱗片、皮膚、肌肉及尾鰭，立即測定蝦青素含量[12]。稱取約2 g皮膚，剪碎，放入25 mL棕色容量瓶中，按質量體積比1∶5加10 mL提取劑(二氯甲烷∶甲醇1∶3)，25 ℃超成波萃取9 min，每隔1 h萃取一次，然后3000 r/min離心15 min，收集上清液，再向殘渣中加入提取劑，重復萃取離心，直至殘渣變?yōu)榛野咨?。合并上清液，及蝦青素粗提物。向粗提物中加入1/3 2%氫氧化鉀-甲醇溶液，黑暗環(huán)境下，室溫皂化8 h，2500 r/min離心10 min，在478 nm波長下測定OD值，根據(jù)標準曲線計算蝦青素含量。

1.3.5 抗氧化力指標測定

采用南京建成生物科技研究所試劑盒測定檢測總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)活性，采用722 可見分光光度計進行比色定量測定。飼養(yǎng)實驗結束后，每缸抽取試驗魚3尾，取兩份0.2 g肝臟，用0.85%冰生理鹽水沖洗2～3遍，再用吸水紙吸干表面的水分，一份與0.85%冰生理鹽水按1∶4在4℃冰水中用手動玻璃勻漿棒研磨至霧狀，制成20%的組織勻漿液，冷藏備用，供T-AOC測定，一份與谷胱甘肽試劑盒中的試劑四按1∶4在4 ℃冰水中用手動玻璃勻漿棒研磨至霧狀，制成20%的組織勻漿液，-20 ℃冷凍備用，供GSH測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和多重比較。利用EXCEL函數(shù)進行相關性分析。

2 結果

2.1 雨生紅球藻對七彩神仙魚生長性能的影響

雨生紅球藻對七彩神仙魚生長性能影響見表2。隨著雨生紅球藻添加量的增加七彩神仙魚的增重率顯著增加，當添加量為9.99 g/kg 時，增重率最大，隨著添加量的繼續(xù)增加，其增重率又逐漸下降；當雨生紅球藻添加量大于3.33 g/kg 時，雨生紅球藻添加組餌料系數(shù)顯著降低，其中添加量為6.66～13.32 g/kg，其餌料系數(shù)較其他3組顯著降低(P<0.05)；各組七彩神仙魚的成活率很高，各組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 雨生紅球藻對七彩神仙魚體色的影響

各雨生紅球藻添加組七彩神仙魚體表三刺激值見表3。隨著雨生紅球藻添加量的增加七彩神仙魚體表的L*值(代表亮度，數(shù)值越大，色澤越淺)逐漸下降，對照組的亮度最高，C4和C5組最低(P<0.05)；隨著雨生紅球藻添加量的增加，七彩神仙魚體表的a*值(代表紅色，數(shù)值越大，顏色越紅)和b*值(代表黃色)也逐漸升高，分別在雨生紅球藻添加量達到13.32 g/kg、16..65 g/kg后，保持基本穩(wěn)定。

表2 飼料中添加雨生紅球藻對七彩神仙魚生長性能的影響

注:同行數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在P<0.05 水平差異顯著。

表3 飼料中雨生紅球藻粉七彩神仙魚體表三刺激值的影響

注:同列數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在P<0.05 水平差異顯著。

利用Excel對七彩神仙魚三刺激值與皮膚中蝦青素含量間進行相關性分析，結果顯示L*值與蝦青素含量相關系數(shù)R為-0.957、a*值與蝦青素相關系數(shù)為0.976、b*值與蝦青素相關系數(shù)為0.891，三刺激值L*、a*和b*與皮膚蝦青素含量的相關性均達到極顯著水平(P<0.01)，其中a*值與皮膚蝦青素含量間的相關系數(shù)絕對值最大，相關性最好。

2.3 雨生紅球藻對七彩神仙魚不同組織蝦青素含量的影響

投喂添加雨生紅球藻的飼料對七彩神仙魚不同組織蝦青素含量的影響見表4。 飼料中添加3.33～16.65 g/kg雨生紅球藻，顯著增加了肝臟和肌肉中蝦青素的含量(P<0.05)；當飼料中雨生紅球藻添加量由0 g/kg增加到3.33 g/kg時，七彩神仙魚皮膚和鰭條蝦青素含量隨雨生紅球藻添加量增高而增加，當雨生紅球藻添加量超過6.66 g/kg，皮膚和鰭條中的蝦青素含量基本趨于穩(wěn)定。

表4 飼料中添加雨生紅球藻對七彩神仙魚不同組織蝦青素含量的影響

注:同行數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著，表5同。

2.4 雨生紅球藻對七彩神仙魚肝臟抗氧化能力的影響

投喂雨生紅球藻對七彩神仙魚肝臟的抗氧化能力影響見表5。雨生紅球藻添加組七彩神仙魚肝臟的總抗氧化能力(T-AOC)和肝臟中谷胱甘肽(GSH)的含量均顯著高于對照組(P<0.05)，并且隨著雨生紅球藻添加量的增加七彩神仙魚肝臟的T-AOC隨之升高，其肝臟中GSH的含量也逐漸升高。

表5 飼料中添加雨生紅球藻對七彩神仙魚肝臟抗氧化力的影響

3 討論

3.1 雨生紅球藻對七彩神仙魚生長性能的影響

蝦青素對養(yǎng)殖生物的生長有顯著的促進作用。金征宇等[13]報道了喂食富含蝦青素的法夫酵母可使羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的增重率明顯提高,實驗表明喂食5周后增重率約達到14.48%。黃璞祎等[14]研究表明在飼料添加一定量的蝦青素可以提高七彩神仙魚的增重率和特定生長率。Zatkova等[15]報道了在甌鯰(Silurusglanis)飼料中添加富含蝦青素的微藻可以提高其特定生長率11%～58%。大西洋鮭(Salmosalar)[16]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[17]在攝食添加蝦青素的飼料時，平均體重較對照組有明顯增加。蝦青素促進魚類生長的原因可能是由于蝦青素可以促進魚體組織維生素A蓄積[16]，而維生素A是魚類的生長發(fā)育和維持正常生理功能必不可少的營養(yǎng)素[18]。本研究表明飼料中添加6.66～13.32 g/kg的雨生紅球藻可以顯著提高七彩神仙魚的增重率，明顯地降低餌料系數(shù)。本實驗中高雨生紅球藻添加組(16.65 g/kg)的七彩神仙魚的增重率顯著下降，這與牟文艷等[19]和孔劉娟等[20]報道的高水平蝦青素添加組可以抑制血鸚鵡生長結果類似，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，有待進一步研究。

3.2 雨生紅球藻對七彩神仙魚體色的影響

魚類自身不具備合成相關色素的能力，所以外源色素的性質和劑量是影響其色斑形成的重要原因。通過在飼料中添加一定量的色素來調(diào)節(jié)養(yǎng)殖對象的體色是目前控制水生生物體色的主要手段。吳華昌等[21]在飼料中添加100 mg/kg的葉黃素可以明顯的使黃顙魚體色增黃；史少奕等[22]在雜交鯰(SilurusmeridionalisChen×SilurusasotusLinnaeus)普通蝦青素具有較好的增色效果；張曉紅等[23]研究了蝦青素和螺旋藻均可以有效改善血鸚鵡體色，且蝦青素增色效果更好，建議適宜添加量為500 mg/kg；Chien等[24]研究表明飼料中添加天然蝦青素(雨生紅球藻)和人工蝦青素(Carophyll Pink,Roche)可以提高日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus)肌肉和蝦殼中蝦青素的含量；Zhang等[12]研究表明飼料中添加不同來源的蝦青素(DSM、BASF和廣州智特奇)可以提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)肌肉中蝦青素含量并可以提高機體的抗氧化能力。本試驗中結果表明，飼料中添加一定量的雨生紅球藻粉對七彩神仙魚具有較好的著色效果，尤其是皮膚和鰭條的著色效果尤為顯著；相比于低添加量(3.33和6.66 g/kg)，高添加劑量(9.99、13.32和16.65 g/kg)對七彩神仙魚皮膚和鰭條的增色效果沒有顯著提高(P<0.05)。隨著雨生紅球藻添加量的增加其肝臟和肌肉中蝦青素的含量逐漸升高。而七彩神仙魚作為觀賞魚，添加雨生紅球藻主要目的是為了增色，所以建議七彩神仙魚的適宜添加量為3.33～6.66 g/kg。

定量評價投喂類胡蘿卜素等增色劑對魚類的增色效果，一般是通過魚鱗黑色素細胞計數(shù)法、分光光度法或高效液相色譜分析測定魚體的類胡蘿卜素[4,25 -26]，但這些方法都需要從魚體身上取下鱗片或皮膚，因而要損傷魚體。這些方法對于高價值的觀賞魚類顯然不適用。

近年來利用測色色差計測定觀賞魚體色的研究越來越多。張曉紅等[17]研究表明血鸚鵡體色的三刺激值與皮膚總類胡蘿卜素含量有極高的相關性，可用測色色差計測定血鸚鵡的三刺激值,并以此來推算魚體皮膚總類胡蘿卜素含量，定量評價血鸚鵡的體色。冷向軍等[27]報道飼料中添加葉黃素0～150 mg/kg時，金魚體表的+ a*值(紅色度)隨蝦青素添加量的增加而增加，L*值(明度) 隨蝦青素添加量的增加而降低；當蝦青素添加量大于150 mg/kg后，+ a*和L*值基本保持穩(wěn)定。色差值的變化規(guī)律與鱗片、皮膚蝦青素含量的變化具有基本一致的趨勢，也與肉眼所見色澤變化相一致，可用來對觀賞魚體色進行定量判別。陳林等[28]利用色差儀的三刺激值評價四種黃色增色劑對金魚體色的增色效果。崔培等[29]利用色差儀的三刺激值研究了在不同蛋白水平下錦鯉對蝦青素吸收及體色的影響。本實驗用測色色差計測定七彩神仙魚的體色發(fā)現(xiàn)，魚體體色的三刺激值亮度(L值)隨雨生紅球藻添加量的增加而減小，紅度和黃度(a值和 b值)隨隨雨生紅球藻添加量的增加而增大，與七彩神仙魚皮膚中蝦青素含量的變化存在密切的相關關系，其中 a 值與蝦青素含量的相關性最好。因此可用測色色差計測定七彩神仙魚的三刺激值作為七彩神仙魚體色的定量指標，從而達到快速和無損定量檢測七彩神仙魚體色和類胡蘿卜素含量的目的。

3.3 雨生紅球藻對機體的抗氧化能力的影響

總抗氧化能力是用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，在機體中分為抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，其大小可代表和反映機體對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態(tài),主要作用是分解和清除代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基[30]。天然蝦青素獨特的分子結構,使其具有強大的清除氧自由基、抑制單線態(tài)氧的能力，是一種比β-類胡蘿卜素、維生素E更為有效的抗氧化劑。然而，關于蝦青素對水生動物的免疫力的影響報道較少。Nakano等[31]用添加10.87 g/kg紅法夫酵母的飼料飼喂虹鱒后顯著降低了血清GPT和GOT的活力及脂質過氧化物的產(chǎn)生。崔惟東等[32]研究表明飼料中添加一定量的蝦青素和角黃素均可以提高虹鱒的總抗氧化能力。這些研究表明蝦青素、角黃素具有提高機體抗氧化能力的作用。本研究結果表明，飼料中添加一定量的雨生紅球藻粉可以顯著提高機體的抗氧化能力。

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(責任編輯：鄧 薇)

Effect of Haematococcus pluvialis on growth，body color and antioxidation capacity of discus fish Symphysodon haraldi

WANG Lei,CHEN Zai-zhong,LENG Xiang-jun,GAO Jian-zhong,LIU Ying, LIU Han-peng,SONG Xue-lu

(CollegeofFisheriesandLifeSciences，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

The present study was conducted to evaluate the effects of dietaryHaematococcuspluvialison body color and antioxidation capacity of discus fishSymphysodonharaldi.Six diets were prepared with the supplementation ofH.pluvialisat levels of 0 (control),3.33，6.66，9.99，13.32 and 16.65 g/kg diet (0，100，200，300，400 and 500 mg/kg astaxanthin),and fed to juvenile discus with initial body weight of 16.74±0.65 g.After 6 weeks rearing,H.pluvialissignificantly stimulated the growth of discus fish,and the discus fish had the highest weight gain when the addition level was 9.99 g/kg.The L*values gradually decreased with the increasingH.pluvialissupplemented level.The a*、b*value and astaxanthin content in skin of fish fedH.pluvialissupplemented diets were significantly higher than those of the control fish (P<0.05).The L*、a*and b*values of skin were highly correlated to the astaxanthin contents in skin of discus fish.The total antioxidation capacity (T-AOC) and glutathione (GSH) of liver in theH.pluvialissupplemental groups was significantly higher than those of control group (P<0.05).The results indicate that supplementingH.pluvialisin diet could enhance the astaxanthin content in skin,improve the body color and promote the antioxidant capacity of discus fish.The supplemental level ofH.pluvialiswas suggested to be 6.66～9.99 g/kg (200～300 mg/kg astaxanthin).

Symphysodonharaldi;Haematococcuspluvialis;astaxanthin;L*,a*,b*score of colorimeter;antioxidation

2016-03-17；

2016-06-20

滬農(nóng)科種字(2015)第19號;水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心(ZF1206)

王 磊(1982- )，男，博士后，專業(yè)方向為觀賞水族營養(yǎng)與飼料。E-mail:wanglei@shou.edu.cn

冷向軍。E-mail:xjleng@shou.edu.cn

S963.73

A

1000-6907-(2016)06-0092-06