, , (天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院, 天津 300384)
·種子生產(chǎn)·
桔梗試管苗再生體系優(yōu)化研究
陳小強,張亞鶴,孫寧
(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院, 天津 300384)
桔梗有極高的藥用作用和觀賞價值。本試驗以桔梗試管苗為外植體,通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根激素種類和濃度,對其再生體系進行優(yōu)化。結(jié)果表明,最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂;最適分化培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂;最適生根培養(yǎng)基為:1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
桔梗; 試管苗; 愈傷組織; 激素; 再生體系
桔梗是桔??平酃俣嗄晟荼局参颷1]。桔梗具有極高的藥用價值、觀賞價值及使用價值[2]。隨著桔梗的各種功用和價值被人們開發(fā)利用,市場需求量日益增大,使得野生桔梗遭受過度的采挖甚至破壞,極大地影響了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、多樣性和物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)[3]。
在生產(chǎn)上,因桔梗是異花授粉植物,主要進行有性繁殖,自然界和生產(chǎn)中推廣的桔梗都是混雜的群體,到目前為止還沒有純系[4]。而且,有性繁殖不利于保持個體的優(yōu)良性狀。通過植物組織培養(yǎng)的方法,不僅可以保持植株的優(yōu)良性狀,而且可以加快其繁育速度,實現(xiàn)工廠化育苗,對保持種質(zhì)資源,新品種的培育具有重要意義。
本試驗通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根的激素的種類和濃度,對其再生體系進行優(yōu)化,希望得到桔梗再生體系所需要的各階段最適培養(yǎng)基配方,為桔梗種質(zhì)資源保存、培育新品種以及工廠化育種提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 試驗材料
桔梗(Platycodongrandiflorus),來源于天津農(nóng)學(xué)院植物細胞工程研究中心。以無病害、健康生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗為研究材料。
1.2 試驗方法
1.2.1 桔梗試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織
取健壯生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗,在超凈工作臺上操作。將健康的試管苗葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形,接種到不同的培養(yǎng)基中(A 1~A 4)。每個處理30重復(fù)瓶,每瓶接2個葉片。接種后培養(yǎng)30 d,觀察愈傷組織形態(tài)并統(tǒng)計出愈率。將MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,碳源選擇30 g/L蔗糖,瓊脂6.5 g/L。添加植物激素如表1。
表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基植物激素配比
序號植物激素(mg/L)2,4?D6?BANAAA13A24A30.10.1A40.50.5
1.2.2 桔梗試管苗分化培養(yǎng)
取健康生長的桔梗試管苗愈傷組織,在超凈工作臺上切剝成0.5 cm3的小塊。接種到培養(yǎng)基(B 1~B 9)中。接種后培養(yǎng)30 d,統(tǒng)計桔梗不定芽分化率并觀察不定芽狀態(tài)。每個處理重復(fù)接15瓶,每瓶接2個愈傷組織。以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,碳源選擇30 g/L的蔗糖,瓊脂6.5 g/L。將6-BA和NAA都分為3個濃度梯度(6-BA:0.5、1、2 mg/L;NAA:0.05、0.1、0.2 mg/L),利用正交設(shè)計法選出最適宜桔梗不定芽分化的培養(yǎng)基。添加的植物激素種類、濃度如表2。
表2 分化培養(yǎng)基植物激素配比
因素水平(mg/L)6?BA0.51.02.0NAA0.050.10.2
1.2.3 桔梗試管苗生根培養(yǎng)
取健壯生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗,在超凈工作臺上操作,將桔梗試管苗轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基(C 1~C 3)中。接種后培養(yǎng)40 d,統(tǒng)計出根率、平均根長以及根的狀態(tài)。每個處理接30瓶,每瓶接2個。設(shè)定1/2 MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,蔗糖30 g/L,瓊脂6.5 g/L。NAA分成3個濃度梯度(0.1、0.25、0.5 mg/L) ,篩選出最適合桔梗生根培養(yǎng)基。C 1:1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂;C 2:1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂;C 3:1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
1.3 培養(yǎng)條件
培養(yǎng)室的溫度保持在(25±2)℃,相對濕度70%~80%,光照時間14~16 h/d,光照強度1 000~5 000 lx。
1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計
出愈率(%)=生長出的愈傷組織個數(shù)/接種葉片個數(shù)×100%;
不定芽誘導(dǎo)率(%)=分化出芽/接種的愈傷組織個數(shù)×100%;
生根率(%)=生根的個數(shù)/接種個數(shù)×100%;
平均根長(cm)=根總長度/根數(shù)。
2.1 不同激素濃度配比對桔梗試管苗葉片出愈率的影響
按照試驗方法操作,將桔梗試管苗剪切后的葉片作為外植體,接種到添加不同濃度植物激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(A 1~A 4),經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后,統(tǒng)計桔梗葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況,包括出愈率和愈傷組織狀態(tài),具體見表3,圖1。
表3 桔梗葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況
處理接種數(shù)(個)愈傷數(shù)(個)出愈率(%)愈傷組織狀態(tài)A1603050.00黃綠色、少量愈傷A2604168.33綠色、濃密愈傷A3601728.33淺黃色、少量愈傷A4601830.00淺黃色、少量愈傷
從圖1可以得出,處理組A 1、A 2都高于A 3、A 4,這說明,在本試驗中,2,4-D對桔梗試管苗葉片的愈傷組織誘導(dǎo),明顯高于6-BA和NAA的配比。當2,4-D濃度為3 mg/L時,出愈率達50%;當濃度上升為4 mg/L,出愈率為68.33%,此時愈傷組織呈綠色,比A 1組顏色稍深,數(shù)量較多。當使用6-BA和NAA配比的植物激素時,出愈率為30%左右,愈傷組織呈黃白色,雖然A 4組比A 3組好些,但遠不如添加2,4-D的A 1,A 2處理組。綜合比較,A 2處理的出愈率最高(68.33%),而且愈傷組織形態(tài)最好,呈現(xiàn)為綠色且較為濃密,見圖2。此時最適的培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
圖1 不同激素處理對桔梗試管苗出愈率影響
圖2 桔梗愈傷組織(30 d)
2.2 不同激素濃度配比對桔梗試管苗分化的影響
將桔梗愈傷組織接種到B 1~B 9分化培養(yǎng)基中,經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后,統(tǒng)計分化率、不定芽狀態(tài)如表4。
從圖3可以看出,當6-BA濃度一定時,NAA濃度越高,愈傷組織分化率越高。當NAA濃度一定時,桔梗試管苗不定芽分化率隨6-BA增加而減少。不定芽狀態(tài)也隨6-BA濃度增加而變差。
由表4可知,分化率最高的是B 3培養(yǎng)基,分化率為80%。B 7培養(yǎng)基分化率最低,為20%。對正交試驗結(jié)果進行分析得出:各因素的極差由大到小依次為R NAA(26.670)gt;R 6-BA(25.553),由此得出,各因素對分化率影響大小為NAAgt;6-BA。對于因素6-BA,K1(64.443)gt;K2(56.667)gt;K3(38.890),說明不同濃度的6-BA對桔梗分化率能力由強到弱依次為0.5gt;1.0gt;2.0。對于因素NAA,K3(67.780)gt;K2(51.110)gt;K1(41.110),說明不同濃度的NAA對桔梗分化率能力由強到弱依次為0.2gt;0.1gt;0.05。比較各個因素K值,最大的K值是因素NAA的K3(67.780),因素6-BA的K1(64.443)。因此理論上9種培養(yǎng)基中最適合的處理組為B 3。
圖4 C 1~C 3組桔梗試管苗生根情況
當6-BA濃度為0.5 mg/L,NAA濃度為0.2 mg/L,不定芽分化率最高,不定芽狀態(tài)最好。確定最適的分化培養(yǎng)基配方為:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
表4 桔梗不定芽分化情況
處理植物激素6?BANAA不定芽(個)分化率(%)不定芽狀態(tài)B10.50.051653.33+B20.50.11860.00++B30.50.22480.00+++B41.00.051550.00++B51.00.11653.33+B61.00.22066.67++B72.00.05620.00-B82.00.11240.00+B92.00.21756.67+K164.44341.110K256.66751.110K338.89067.780R25.55326.670
注:“+++”表示分化狀態(tài)情況良好,“++”表示分化狀態(tài)情況較好,“+”表示分化狀態(tài)情況一般,“-”表示分化狀態(tài)情況差。
2.3 不同激素濃度配比對桔梗試管苗生根的影響
按照試驗方法操作,桔梗試管苗接種到C 1~C 9培養(yǎng)基,在經(jīng)過40 d的培養(yǎng)后,統(tǒng)計出根率、平均根長、根部狀態(tài)(表5)。
表5 桔梗生根情況
處理接種數(shù)(個)污染數(shù)(個)生根數(shù)(個)出根率(%)平均根長(cm)根狀態(tài)C16034981.671.75極細,數(shù)目少C26015490.002.81粗壯,密集叢生數(shù)目多C36025795.002.12較細,數(shù)量較多
由表5和圖4可知,當NAA濃度為0.1 mg/L時,根極細,且數(shù)目少(圖4 C 1);當濃度為0.25 mg/L,根非常粗壯,密集,數(shù)量很多(圖4 C 2)。當濃度為0.5 mg/L,根較粗,數(shù)量較多(圖4 C 3);可以得出,生根率最高的雖然是NAA為0.5 mg/L的C 3組處理(達94.44%),但觀察試管苗生根情況卻發(fā)現(xiàn),C 2組長勢明顯好于C 3處理組。C 2組根密集叢生,根的數(shù)目非常多,且非常粗壯;C 3組根的數(shù)目雖然長,但普遍較細。所以,本試驗中,最適宜桔梗試管苗莖段生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
圖3 不同激素處理對桔梗不定芽分化的影響
3.1 不同濃度植物激素配比對桔梗試管苗愈傷組織形成的影響
愈傷組織是指植物在局部受到創(chuàng)傷或刺激后,在傷口附近形成新生的組織。在離體培養(yǎng)中,細胞經(jīng)過脫分化等過程,繼而轉(zhuǎn)變成一種可以迅速增殖的細胞團,即為愈傷組織。由本試驗結(jié)果可以看出,不同激素配比對桔梗試管苗葉片快繁中愈傷組織的形成有顯著影響。從目前的研究成果來看,采用2,4-D或6-BA、NAA配比來誘導(dǎo)愈傷的方案比較多。2種方案在當前研究中都有試驗的數(shù)據(jù)支撐。張鳳生等的試驗結(jié)果表明,在植物激素種類為6-BA和NAA時,愈傷組織誘導(dǎo)效果好,呈現(xiàn)良好的綠色顆粒狀,且愈傷組織數(shù)目較多[5]。王桂梅等的試驗結(jié)果也指出,6-BA和NAA有利于誘導(dǎo)愈傷組織[6]。曾思思等利用桔梗為外植體,研究愈傷組織的誘導(dǎo),明確指出,2,4-D是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵激素[7]。舒孌認為,2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織的效果非常強,誘導(dǎo)率可達100%[8]。本試驗也驗證了這點,認為4 mg/L的2,4-D對桔梗愈傷組織誘導(dǎo)是最有利的。從出愈時間來看,本試驗中,平均出愈時間為16~25 d,而吳京姬等的試驗指出,在添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基接種7 d后,葉片周圍的傷口的細胞團即可長出愈傷組織[9]。出愈時間可能與桔梗品種有關(guān)。
3.2 不同濃度激素配比對桔梗試管苗愈傷組織分化的影響
不同激素配比對桔梗試管苗愈傷組織分化的影響也不同。張燕等指出,桔梗愈傷組織分化的培養(yǎng)基添加的最適激素為6-BA和NAA[10],這與陳慶亮等[11]的試驗研究結(jié)果一致。本試驗利用正交設(shè)計法探究不同激素配比對愈傷組織分化影響,選出最適宜桔梗不定芽分化的培養(yǎng)基。試驗結(jié)果表明,6-BA濃度一定時,NAA濃度越高,愈傷組織分化率越高。B 3組處理中,當6-BA濃度為0.5 mg/L,NAA濃度為0.2 mg/L時,愈傷組織分化率最高,可達80%。
3.3 不同濃度激素配比對桔梗試管苗生根的影響
在桔梗試管苗生根階段,NAA是大家普遍認同的能促進根分化的植物激素。但使用質(zhì)量濃度有分歧,基本在0.1~0.5 mg/L。例如唐偉斌等在試驗中明確指出,添加NAA能有效促使根系生長,最適的生根配方是添加濃度為0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基[12]。同樣認為,NAA有利于生根的有曾宣姣等[13]的試驗,但最終確定的NAA濃度梯度與前者不同,后者認為,NAA選用0.1 mg/L效果最佳?;谏鲜龆际菍⒔酃T嚬苊缱鳛橥庵搀w,添加不同濃度的NAA,但試驗結(jié)果不同,顯示的濃度范圍較大,綜合多個試驗項目,本試驗控制單一變量,將NAA濃度設(shè)置為0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L 3個梯度。經(jīng)過40 d培養(yǎng)可得出,生根率最高的是第C 3組處理(NAA為0.5 mg/L),生根率達94.44%,但試管苗形態(tài)根據(jù)圖4可發(fā)現(xiàn)C 2組長勢明顯好于C 3處理組。C 2組根密集叢生,根的數(shù)目多且非常粗壯;C 3組根的數(shù)目雖然也多,但普遍較細。
本研究以桔梗試管苗為外植體,通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根的激素的種類和濃度,對其再生體系進行優(yōu)化研究,確定各個階段的培養(yǎng)基配方。得到桔梗再生體系所需要的各階段最適培養(yǎng)基配方為:
1) 愈傷組織誘導(dǎo):MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
2) 愈傷組織分化:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
3) 試管苗生根:1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L瓊脂。
[1]魏尚洲.桔梗資源的綜合開發(fā)利用[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報,2005,23(5):141-143.
[2]楊春.藥用植物學(xué)[M]上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:296.
[3]張小斌,雷燕妮.不同條件對桔梗種子萌發(fā)影響研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,61(1):14-16.
[4]徐芳芳,趙麗莉,荀洋,等.6-BA濃度對桔梗胚珠愈傷組織分化率的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):2 552—2 553.
[5]張鳳生,姜淼,李建紅.桔梗的組織培養(yǎng)及快速繁殖[J].北方園藝,2007(1):165.
[6]王桂梅,賀美忠,楊富.桔梗組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2012,18(7):70-71.
[7]曾思思,彭豹,劉清波,等.桔??旆斌w系的建立[J].農(nóng)業(yè)工程,2014,7(4):159-161.
[8]舒孌,高山林.桔梗的組織培養(yǎng)[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2001,10(3):63-64.
[9]吳京姬,吳基日,嚴一宇,等.提高桔梗組織培養(yǎng)效率的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(12):3 565,3 572.
[10]張燕,黎斌,張瑩,等.桔梗植株再生體系的建立及試管內(nèi)開花現(xiàn)象[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,61(10):18-22.
[11]陳慶亮,單成鋼,朱彥威,等.桔梗不育系的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究[J].北方園藝,2010(16):142-144.
[12]唐偉斌,石曉云,宋玉玲,等.桔??焖俜敝硨嶒烍w系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(4):644-645.
[13]曾宣姣,張書娟,胡曉,等.桔梗的組織培養(yǎng)和植株再生[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2015,30(3):103-106.
Research on the Optimization of Regeneration System ofPlatycodongrandiflorusTube Seedlings
CHENXiaoqiang,ZHANGYahe,SUNNing
2016-06-23
天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃“作物品質(zhì)及抗逆性的遺傳改良”(編號:TD 12-5017)。
陳小強(1976—),女,天津人;副教授,博士,主要從事植物細胞工程及遺傳育種相關(guān)工作;E-mail:chenxia9663@126.com。
10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.124
S 567
A
1001-4705(2016)11-0124-04