孫 韜 黃竹娟 蘇 寧*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2. 廣州市豐華生物工程有限公司，廣東 廣州 510730

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高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

孫 韜1,2黃竹娟1蘇 寧1*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2. 廣州市豐華生物工程有限公司，廣東 廣州 510730

目的：研究在高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷干預(yù)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法：本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)在高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷干預(yù)24h、48h、72h 上皮細(xì)胞增殖及凋亡情況，并同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(低糖組)、陽(yáng)性對(duì)照組(高糖組)和陽(yáng)性藥物對(duì)照組(RGZ)。結(jié)果：24h、48h時(shí)間點(diǎn)，黃芩苷干預(yù)下的上皮細(xì)胞以促進(jìn)增殖、抑制凋亡為主要表現(xiàn)；72h時(shí)間點(diǎn)，低劑量黃芩苷(50、100μmol/L)干預(yù)下的上皮細(xì)胞仍以促進(jìn)增殖、抑制凋亡為主要表現(xiàn)，但高劑量黃芩苷組別(200μmol/L)干預(yù)下的上皮細(xì)胞以抑制增殖、促進(jìn)凋亡為主要表現(xiàn)。在高糖環(huán)境下黃芩苷可抑制上皮細(xì)胞凋亡，與陽(yáng)性藥物對(duì)照(RGZ)的趨勢(shì)一致。結(jié)論：黃芩苷可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的藥理作用，發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

黃芩苷；人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)；細(xì)胞凋亡；糖尿病

糖尿病腎病[1](diabetic nephropathy，DN)是以腎臟微血管病變作為最主要表現(xiàn)的糖尿病并發(fā)癥，也是造成慢性腎衰的主要病因，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來(lái)，隨著研究的深入，證實(shí)細(xì)胞凋亡參與DN發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡的重要途徑[2]，細(xì)胞的死亡和更新是多細(xì)胞生物整個(gè)生命過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)，可及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)的多余細(xì)胞和受損傷細(xì)胞，對(duì)各組織器官的發(fā)育及免疫系統(tǒng)的建立發(fā)揮重要作用。通常情況下，細(xì)胞凋亡過(guò)程受機(jī)體內(nèi)嚴(yán)格調(diào)控，以維持整個(gè)生命過(guò)程中各組織器官的穩(wěn)定性。但當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時(shí)，可引起細(xì)胞過(guò)度增殖或過(guò)度凋亡，都是導(dǎo)致糖尿病腎病患者腎功能進(jìn)一步惡化的重要因素之一。

傳統(tǒng)藥物黃芩(scutellaria baicalensis georgi)為唇形科植物黃芩的干燥根，迄今己有2000多年的藥用歷史，該藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，用于“諸熱黃膽，腸泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”。黃芩苷(baicalin bai，BB)是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治療或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥等藥理作用[3]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護(hù)作用[4-8]。在此基礎(chǔ)上，本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察在高糖環(huán)境下不同濃度的黃芩苷對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 HK-2細(xì)胞株購(gòu)自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鹽酸羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(廣東省食品藥品檢驗(yàn)所,批號(hào)20141201)，DMEM 低糖和高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(上海立菲生物技術(shù)有限公司)，胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HK-2細(xì)胞株置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按以4000/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μL 含10%FBS的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期。棄去培養(yǎng)液，將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為7組(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)：A組(NG)：DMEM 低糖培養(yǎng)液(D-葡萄糖濃度為5.5mmol/L)；B組(HG)：DMEM 高糖培養(yǎng)液(D-葡萄糖濃度為25mmol/L)；C組(HG+R5)：DMEM 高糖培養(yǎng)液和RGZ(終濃度為5μmol/L)；D組(HG+R10)：DMEM 高糖培養(yǎng)液和RGZ(終濃度為10μmol/L)；E組(HG+BB50)：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB(終濃度為50μmol/L)；F組(HG+BB100)：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB(終濃度為100μmol/L)；G組(HG+BB200)：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB(終濃度為200μmol/L)。分別干預(yù)24、48、72h，共設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 當(dāng)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束(24、48、72h)時(shí)，使用濃度為5mg/mL的MTT溶液加入待測(cè)孔，孵育4h，棄去廢液，重新加入DMSO 150μL /孔，振蕩10min后，放入iMark 吸收光酶標(biāo)儀(選擇490nm波長(zhǎng)，Bio-Rad 公司)進(jìn)行檢測(cè)并記錄結(jié)果(OD值)。1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。按上述分組方法，以4000/孔的密度將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束(24、48、72 h)時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率(Q2+Q4)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響 在24h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。F組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組別與B組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在48h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組、C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在72h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組和F組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余組別與A組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組、D組和F組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組別與B組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果詳見(jiàn)表1和圖1。

2.2 高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡率的影響 在24h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在48h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中， C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在72h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、E組和與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組、F組與A組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表1 高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響 (OD值)

注：與A組同時(shí)段比較，*P<0.05；與B組同時(shí)段比較，**P<0.05。

表2 高糖環(huán)境下不同濃度黃苓苷對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 (%，Q2+Q4)

注：與A組同時(shí)段比較，*P<0.05；與B組同時(shí)段比較，**P<0.05。

3 討論

MTT比色法是目前檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑鹽在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍(lán)紫色或藍(lán)黑色的MTT-甲肷，形成的量與活細(xì)胞代謝率及細(xì)胞增殖程度成正相關(guān)。在研究中觀察到，在高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞增殖快速(B組與A組比較)，低、中濃度黃芩苷影響下的HK-2細(xì)胞增殖快速，高濃度黃芩苷影響下的HK-2細(xì)胞增殖受抑制，72h觀察時(shí)間點(diǎn)最為顯著。提示高糖對(duì)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生雙重效應(yīng)，既能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，在高濃度藥物環(huán)境下，又可抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)使用的陽(yáng)性對(duì)照組(RGZ)的HK-2細(xì)胞增殖情況與既往研究的報(bào)道[10]基本一致。

流式Annexin V/PI 雙染法是目前比較常用、靈敏較高的細(xì)胞凋亡測(cè)定方法，其主要原理是通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙重?zé)晒鈽?biāo)記以區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。在研究中觀察到，在高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞凋亡顯著增多(B組與A組比較)，結(jié)合MTT檢測(cè)結(jié)果提示在高糖環(huán)境下HK-2呈高增殖伴高凋亡率。在藥物(包括BB、RGZ)影響下，可顯著降低凋亡率。但是高濃度黃芩苷(G組)在72h觀察時(shí)間點(diǎn)的凋亡率較其他用藥組別顯著升高，結(jié)合MTT檢測(cè)中低增殖的表現(xiàn)，考慮高濃度黃芩苷促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡，抑制HK-2細(xì)胞增殖，而低、中濃度黃芩苷抑制HK-2細(xì)胞凋亡、促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果[4-8]提示黃芩苷可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的藥理作用，發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

[1]石巖,楊宇峰.中西醫(yī)結(jié)合糖尿病學(xué)[M].沈陽(yáng):遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2014:56-57.

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(編輯：穆麗華)

Effect of Baicalin Bai on HK-2 cells Apoptosis in High GLucose Medium

SUN Tao1,2HUANG Zhujuan1SU Ning1＊

1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China；2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co., Ltd , Guangzhou 510730, China

Objective To study the effect of Baicalin Bai(BB) on HK-2 cells apoptosis in high glucose medium.Methods The cell proliferation was detemined with MTT method at 24h，48h，72h respectively after HK-2 cells were incubated with normal glucose, high glucose, high glucose plus RGZ or high glucose plus BB.Results At 24h & 48h，in comparison with NG & HG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly. At 72h，in comparison with NG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly except for the high - dose HG+BB group(200μmol/L).During the observation，the effect of BB on HK-2 cells growth cultured in high glucose medium is facilitative mainly, it′s similar to RGZ in concentration and times．Conclusion BB pharmacological effects by inhibiting apoptosis, play a protective effect on the kidneys.

HK-2；Kidney Tubules；Cell Division；High Glucose

2016-08-23

孫韜(1984-)，男，漢族，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治代謝性疾病。E-mail:dick_hill@163.com

蘇寧(1966-)，女，漢族，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。主要從事中醫(yī)藥防治免疫相關(guān)性疾病的研究。E-mail:suning@gzucm.edu.cn

R285.5

A

1007-8517(2016)21-0029-03