孫 濤 周喆炎 邊 莉 徐開軍 馬 薈

(云南省第三人民醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011)

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·腫 瘤·

異檸檬酸脫氫酶作為肺癌標志物的臨床意義

孫 濤 周喆炎 邊 莉1徐開軍 馬 薈

(云南省第三人民醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011)

目的 探討異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)作為肺癌標志物的臨床意義。方法 RT-PCR檢測收集的50例肺癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中IDH1、激活蛋白激酶C1受體(RACK1)、過氧化物氧化還原酶2(PRDX2)的表達水平。ELISA檢測收集的50例肺癌患者及20例正常人血漿標本中IDH1的表達水平。以肺癌細胞A549為研究對象，轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA抑制肺癌細胞中IDH1的表達，MTT檢測轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d的肺癌細胞增殖情況。流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后48 h的細胞凋亡情況。結(jié)果 IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織中均過度表達，IDH1相對于癌旁組織表達量上調(diào)最多。20例正常人血漿中IDH1水平中位數(shù)為3.48 U/L，50例肺癌患者血漿中IDH1水平中位數(shù)為6.55 U/L，組間比較差異顯著(P<0.01)。IDH1 siRNA組肺癌細胞A549細胞存活率與siRNA control組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)。siRNA control組細胞凋亡率為0.12±0.01，與IDH1 siRNA組(0.41±0.02)比較差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 IDH1在肺癌組織和血漿中高表達。抑制IDH1可以抑制肺癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡。IDH1可以作為肺癌標志物用于診斷肺癌。

肺癌；異檸檬酸脫氫酶1

肺癌的發(fā)生與吸煙、職業(yè)、遺傳等多種因素有關(guān)。肺癌發(fā)病早期癥狀不明顯，確診時一般為肺癌中晚期，耽誤了最佳的治療時機。小分子標志物診斷癌癥是目前研究較多的癌癥診斷方法。

異檸檬酸脫氫酶(IDH)廣泛存在于真核生物體內(nèi)，是由IDH基因編碼的一種蛋白酶〔1〕。IDH1是IDH的一種亞型，在預(yù)防應(yīng)激、胰島素分泌、射線抵御等方面具有重要作用。已經(jīng)有研究表明，肺癌組織和正常的癌旁組織中 IDH1、激活蛋白激酶C1受體(RACK1)、過氧化物氧化還原酶2(PRDX2)為差異表達蛋白，而且參與了腫瘤相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)〔2〕。本研究通過對比肺癌細胞中IDH1、RACK1、PRDX2的表達水平，研究其對肺癌細胞的作用，以期為診斷肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌組織、血漿樣本及細胞系 肺癌組織及對應(yīng)的正常癌旁組織50例，50例肺癌患者及20例正常人血漿標本均來自2011年7月至2016年7月云南省第三人民醫(yī)院和昆明醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院，患者已簽署知情協(xié)議書，組織標本和血漿標本性別年齡均無顯著差異。肺癌細胞系A(chǔ)549購于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心。

1.1.2 主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；超凈工作臺，北京中科院；倒置顯微鏡，日本尼康；酶標儀，北京柏邁科技有限公司；水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司；離心機，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒；RT-PCR檢測試劑盒，寶生物工程(大連) 有限公司；Matrigel，上海前塵生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青有限公司；PBS，碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基青鏈霉素胰蛋白酶，上海春曉生物技術(shù)有限公司；MTT，上海前塵生物科技有限公司；IDH1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海易利生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測組織樣本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 收集的50例肺癌組織和對應(yīng)的正常癌旁組織隨機編號為1～50，每一組取0.2 g組織樣本放置于組織研磨管中，加入1 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)，勻漿器研磨后轉(zhuǎn)移到離心管中，3 000 r/min離心5 min后，棄上清液。在組織沉淀中加入TRIzol裂解液，充分混勻后，放置于室溫下充分裂解6 min，加入200 μl氯仿，震蕩混合后置于室溫下靜置3 min。12 000 r/min，4℃離心5 min，收集上清液。在上清液中加入600 μl的75%乙醇溶液，混勻后10 000 r/min離心5 min，棄上清液，在室溫下干燥10 min，加入適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成IDH1、RACK1、PRDX2 mRNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書分析IDH1、RACK1、PRDX2轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.2 ELISA法檢測正常人和肺癌患者血漿中IDH1的表達 收集的50例肺癌患者和20例正常人血漿標本，利用雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒檢測血漿標本中的IDH1水平。用酶標儀檢測每孔的吸光度，波長為450 nm。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的肺癌細胞A549，放置于37℃的水浴鍋中孵育5 min，觀察凍存管中的液體全部融化后，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。在細胞沉淀中加入2 ml含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基，充分混勻，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞融合度為90%時，棄細胞生長液，在細胞中加入PBS洗滌細胞兩次，加入0.25%胰蛋白酶，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化3 min，觀察細胞呈單個存在時，加入細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入PBS洗滌細胞后，加入細胞生長液，接種于細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞呈單個細胞，加入PBS洗滌細胞兩次，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到85%時，將細胞生長液更換為不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液分別與IDH1 siRNA和siRNA control混合后，室溫下靜置5 min，為A液。轉(zhuǎn)染試劑與不完全培養(yǎng)液混合后，在室溫下靜置20 min，為B液。A液與B液混合后，室溫下靜置20 min，與細胞混合后，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌細胞A549，加入胰蛋白酶消化細胞后，用PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min，加入細胞培養(yǎng)液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整每孔中細胞個數(shù)為20 000個，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，待細胞貼壁后，棄細胞生長液，更換新的細胞生長液，培養(yǎng)時間分別為1、2、3、4、5、6 d。加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸除上清液，加入150 μl的DMSO溶液，避光條件下反應(yīng)10 min，直至結(jié)晶物完全溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的吸光度(OD值)，分析細胞增殖情況。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌細胞A549培養(yǎng)48 h后，棄去細胞生長液，在細胞中加入0.25%胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心細胞10 min，在細胞沉淀中加入PBS懸浮細胞后，1 000 r/min離心10 min，加入細胞生長液，使得每毫升細胞懸浮液中含有2×106個細胞。取1 ml的細胞懸浮液，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集細胞沉淀，加入適量的結(jié)合緩沖液后，在細胞中加入5 μl Annexin V和5 μl PI混合，室溫下孵育反應(yīng)10 min后，流式細胞儀檢測每組細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測組織樣本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 以正常的癌旁組織中IDH1、RACK1、PRDX2水平為參照(設(shè)為1)，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織中均過度表達(分別為3.09±0.15，2.16±0.17，2.20±0.11)，IDH1相對于癌旁組織表達量上調(diào)最多，故選用IDH1進行后續(xù)研究。

2.2 ELISA檢測肺癌患者和正常人血漿中IDH1水平 20例正常人血漿中IDH1水平中位數(shù)為3.48 U/L，50例肺癌患者血漿中IDH1水平中位數(shù)為6.55 U/L，組間比較差異顯著(P<0.01)。見圖1。

圖1 正常人和肺癌患者血清中IDH1含量

2.3 MTT檢測細胞增殖結(jié)果 IDH1 siRNA組肺癌細胞A549細胞存活率與siRNA control組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)。轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA可抑制細胞中IDH1的表達，進而有效抑制肺癌細胞的增殖。見表1。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 IDH1 siRNA組的肺癌細胞凋亡率為(0.41±0.02)，明顯多于siRNA control組(0.12±0.01，P<0.05)?？梢姡种艻DH1的表達可以有效促進肺癌細胞A549，凋亡。

表1 MTT檢測轉(zhuǎn)染后的肺癌細胞A549增殖情況

與siRNA control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)每年大約有160萬新增肺癌患者，有140萬人死于肺癌，肺癌的死亡人數(shù)占惡性腫瘤死亡人數(shù)的19%。在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均為惡性腫瘤中的第一位，其中城市肺癌的死亡率較農(nóng)村高，男性的死亡率較女性高。肺癌發(fā)病隱匿，約有70%的肺癌患者確診時已經(jīng)為肺癌晚期。

分子標記物在多種疾病的診斷中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。癌癥標志物在正常組織和癌癥組織中差異表達，可以是癌基因、抑癌基因或者與癌癥相關(guān)的基因、抗原〔3～5〕，在腫瘤的診斷中具有監(jiān)測作用。

IDH1基因在人類染色體2q33上，細胞質(zhì)內(nèi)的IDH1可以促進NADPH產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)谷胱甘肽的循環(huán)再生〔6〕。IDH1參與細胞代謝，在與葡萄糖相關(guān)的胰島素分泌中具有調(diào)控作用〔7，8〕。已經(jīng)有研究表明，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織和癌旁組織中差異表達〔9〕。本研究結(jié)果顯示，IDH1在肺癌組織中表達上調(diào)最為明顯，并且肺癌患者血漿中IDH1含量明顯高于正常人。抑制細胞中IDH1的表達，可以有效抑制肺癌細胞的增殖，并且明顯促進肺癌細胞凋亡。

綜上所述，IDH1在肺癌組織中過度表達，發(fā)揮癌基因的作用。抑制IDH1的表達可以抑制肺癌細胞的增殖，促進肺癌細胞凋亡。這說明IDH1是一種潛在的肺癌標志物，為診斷和治療肺癌提供了新思路。

1 Chotirat S，Thongnoppakhun W，Wanachiwanawin W，etal.Acquired somatic mutations of isocitrate dehydrogenases 1 and 2(IDH1，and IDH2) in preleukemic disorders〔J〕.Blood Cells Mol Dis，2015；54(3)：286-91.

2 Stein EM.IDH2 inhibition in AML：finally progress〔J〕.Best Pract Res Clin Haematol，2015；28(2-3)：112-5.

3 田 俠，劉愛軍，曹 晨，等.分子標志物在子宮內(nèi)膜癌中的表達分析〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015；15(10)：1891-4.

4 Braunschweig T，Chung JY，Choi CH，etal.Assessment of a panel of tumor markers for the differential diagnosis of benign and malignant effusions by well-based reverse phase protein array〔J〕.Diag Pathol，2015；10(1)：1-10.

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7 Stancheva G，Goranova T，Laleva M，etal.IDH1/IDH2 but not TP53 mutations predict prognosis in Bulgarian glioblastoma patients〔J〕.Biomed Res Int，2014；2014(1)：251-78.

8 Cimino PJ，Kung Y，Warrick JI，etal.Mutational status of IDH1 in uveal melanoma〔J〕.Exp Mol Pathol，2016；100(3)：476-81.

9 孫 楠.異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)作為新的非小細胞肺癌標志物的研究〔D〕.北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2014.

〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

云南省教育廳科學研究基金項目(2010Y188)

孫 濤(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事肺、乳腺腫瘤研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)21-5337-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.056

1 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科