袁高慶, 陳媛媛, 范腕腕, 黎起秦, 林 緯

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004)

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3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯防治番茄青枯病的物理作用方式及其對(duì)番茄根系次生代謝物質(zhì)的影響

袁高慶, 陳媛媛, 范腕腕, 黎起秦, 林 緯

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004)

通過(guò)生物學(xué)方法測(cè)定3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(MG)防治番茄青枯病的物理作用方式,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析該化合物對(duì)番茄根系組織次生代謝物質(zhì)的影響。結(jié)果表明,3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯對(duì)番茄青枯病有較好的預(yù)防作用,持效期較長(zhǎng),施藥15 d 后接種青枯病菌,防效仍達(dá)52.12%;該化合物可快速擴(kuò)散到番茄根系組織內(nèi),但其向植株頂部和基部的輸導(dǎo)作用弱,對(duì)番茄青枯病的治療效果差。番茄根系中共鑒定出36種次生代謝物質(zhì),與對(duì)照相比,3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯處理對(duì)番茄根系次生代謝產(chǎn)物的組成和相對(duì)含量有明顯影響,其中與抑菌活性相關(guān)的物質(zhì)有香葉醇、豆甾醇、β-谷甾醇和木栓醇等4種,前3種物質(zhì)在3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯處理植株體內(nèi)表現(xiàn)為含量顯著升高,木栓醇則為苗期用3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯處理后番茄根系新增的化合物。

3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯; 番茄青枯病; 物理作用方式; 次生代謝物質(zhì)

茄青枯拉爾氏菌[Ralstoniasolanacearum(Smith) Yabuuchi et al.]可引起多種植物的青枯病,廣泛分布于熱帶、亞熱帶及某些溫帶地區(qū),并有逐漸向高緯度冷涼地區(qū)蔓延的趨勢(shì)[1-2]。防治青枯病必須采取綜合措施,其中藥劑防治依然是重要的防控措施之一,但目前用于防治青枯病的藥劑品種單一,亟待開(kāi)發(fā)出新型藥劑。本文作者前期研究發(fā)現(xiàn),木蠟樹(shù)(Toxicodendronsylvestre)中的3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(methyl gallate,MG)對(duì)多種植物病原菌具有較強(qiáng)的離體抑制活性,可顯著影響茄青枯拉爾氏菌生長(zhǎng)、能量代謝和蛋白質(zhì)表達(dá)等[3-4],且MG 穩(wěn)定性好,在溫室及大田條件下均可有效控制番茄青枯病的發(fā)生[3,5]。MG屬于酚酸酯類(lèi)化合物,廣泛存在于自然界多種植物中,具有抗氧化、抑菌、抗病毒、對(duì)抗血小板聚集等多種生物活性[6]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,Ahn等報(bào)道MG對(duì)稻瘟病、小麥葉銹病和黃瓜灰霉病有較好的防治效果[7];Méndez等將MG施用于菜豆后發(fā)現(xiàn), MG被糖苷化形成3-glucosyl methyl gallate,從而影響菜豆不定根的生長(zhǎng)[8-9]。雖然已知的研究報(bào)道證實(shí)MG有廣譜的抑菌活性和較好的病害防治效果,有作為殺菌劑開(kāi)發(fā)利用的潛力,但有關(guān)其防治植物病害的作用方式以及對(duì)植物生長(zhǎng)代謝的研究鮮有報(bào)道。本文通過(guò)生物學(xué)方法測(cè)定MG防治番茄青枯病的物理作用方式,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)方法分析MG對(duì)番茄根系組織次生代謝物質(zhì)合成的影響,從而可以進(jìn)一步揭示MG有效控制番茄青枯病的機(jī)制,為合理應(yīng)用MG防治植物病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄品種為‘金卡紅’,屬于高感青枯病品種,由廣州金卡農(nóng)業(yè)科技有限公司提供;培養(yǎng)番茄所用基質(zhì)為全價(jià)育苗基質(zhì)(有機(jī)質(zhì)+腐殖酸≥50%),由長(zhǎng)春市賽世農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司生產(chǎn);茄青枯拉爾氏菌菌株Rs-T02由廣西大學(xué)植物病理學(xué)研究室提供,使用時(shí)以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液在28℃130 r/min條件下振蕩培養(yǎng);3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(MG)為人工合成,純度大于99%,由阿拉丁試劑有限公司提供,使用時(shí)用10%甲醇配制成MG母液。

1.2 MG防治番茄青枯病的物理作用方式測(cè)定

1.2.1 番茄苗的培育

在玻璃溫室中(28±5)℃以育苗基質(zhì)培育番茄苗至長(zhǎng)出真葉,移入塑料盆中以水培法培育,每星期更換1次培養(yǎng)液,至4～5葉期,用于測(cè)定MG的作用方式。其中水培營(yíng)養(yǎng)液成分及用量為:A液，Ca(NO3)2·4H2O 59 g,KNO340.4 g,水1 000 mL;B液，KH2PO413.6 g,MgSO4·7H2O 24.6 g,水1 000 mL;C液，NaFe-EDTA 30 g,MnSO4·4H2O 2.13 g,ZnSO4·7H2O 0.22 g,CuSO4·5H2O 0.08 g,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 g,水1 000 mL。取A液8 mL、B液8 mL、C液0.8 mL,加水補(bǔ)足5 L即為每一栽培盆的水培用量。

1.2.2 MG的擴(kuò)散作用測(cè)定

培養(yǎng)液中加入MG母液使其終濃度分別為10 μg/mL和20 μg/mL,番茄植株在其中分別培養(yǎng)24 h和48 h后,用流動(dòng)清水反復(fù)沖掉番茄苗根系及根莖部表面的MG,植株備用。同時(shí),在新鮮的培養(yǎng)液中加入振蕩培養(yǎng)24 h的青枯菌Rs-T02,使其濃度為107cfu/mL。將植株移至含菌培養(yǎng)液中,以清水處理為對(duì)照,每個(gè)處理20株,3次重復(fù)。觀察番茄植株發(fā)病情況,當(dāng)植株部分枝條或全株出現(xiàn)萎蔫癥狀并且鏡檢有噴菌現(xiàn)象時(shí),確定為發(fā)病。接種后第30天計(jì)算發(fā)病率和防治效果,分析前期處理中MG從根系及根莖部組織表面向內(nèi)的擴(kuò)散作用。發(fā)病率和防治效果按以下公式計(jì)算。

發(fā)病率(%)=(病株數(shù)/總株數(shù))×100;

防治效果(%)= 100×(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率。

1.2.3 MG向頂輸導(dǎo)作用的測(cè)定

培養(yǎng)液中加入MG母液使其終濃度分別為20 μg/mL和200 μg/mL,番茄植株在其中培養(yǎng)24 h后,將振蕩培養(yǎng)24 h的青枯菌濃度調(diào)整為107cfu/mL用剪刀蘸取菌液，從番茄苗最頂端第一張完全展開(kāi)的葉片的葉尖處剪葉，剪口長(zhǎng)度約為0.5 cm，并使剪口處葉肉組織與剪刀蘸取的菌液接觸2 s,以清水處理為對(duì)照,每個(gè)處理20株,3次重復(fù)。當(dāng)接種葉片所在枝條出現(xiàn)萎蔫癥狀并且鏡檢有噴菌現(xiàn)象時(shí),確定為發(fā)病。以接種后第30天的發(fā)病率和防治效果分析MG是否能夠向植株頂部輸導(dǎo)。

1.2.4 MG向基輸導(dǎo)作用的測(cè)定

分別將濃度為20 μg/mL和200 μg/mL的MG溶液均勻涂抹在番茄苗所有葉片的正反面,24 h后移至含有107cfu/mL青枯菌的培養(yǎng)液中,以清水處理為對(duì)照,每盆20株,每處理3次重復(fù)。以接種后第30天的發(fā)病率和防治效果分析MG是否能夠向植株基部輸導(dǎo)。

1.2.5 MG持效期、預(yù)防作用及治療作用的測(cè)定

番茄植株在營(yíng)養(yǎng)液中長(zhǎng)至4～5葉期后,移至含20 μg/mL MG的新培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24 h后,用清水沖洗根莖部表面,再移至無(wú)MG的培養(yǎng)液中,分別將用20 μg/mL MG處理后0、5、15和20 d的番茄植株同時(shí)移至含107cfu/mL 青枯菌液的新培養(yǎng)液中。對(duì)照植株不用MG處理,與上述MG處理后不同天數(shù)的植株同時(shí)接種。同時(shí)另設(shè)一個(gè)處理觀察MG的治療作用,取未用MG處理的番茄植株,在其培養(yǎng)液中加入青枯菌液進(jìn)行接種,5 d后移至含20 μg/mL MG的新培養(yǎng)液中,以同時(shí)接種的未加MG的番茄植株作對(duì)照,每個(gè)處理20株,3次重復(fù)。最后以接種后第30天的病株率和防治效果分析MG的持效期、預(yù)防作用及治療作用。

1.3 番茄根系次生代謝物質(zhì)的GC-MS分析

1.3.1 樣品的制備

番茄種子催芽露白后植入營(yíng)養(yǎng)缽的育苗基質(zhì)中,每隔7 d灌施20 μg/mL的MG溶液,培育至苗期(4～5葉期),一部分番茄苗用于制備苗期樣品,另一部分移栽至大田,每隔10 d灌施500 μg/mL的MG溶液,連施3次,之后按照常規(guī)對(duì)番茄植株管理至開(kāi)花結(jié)果期,以0.1%甲醇溶劑處理為對(duì)照。苗期和開(kāi)花結(jié)果期番茄根系次生代謝物質(zhì)樣品的制備方法如下:取根系組織清水沖洗,將表面水分吸干,加入液氮研碎,稱(chēng)取3.0 g,快速裝入離心管中,加入2 mL氯仿,置于渦旋振蕩儀上振蕩15 min,之后冷凍離心5 min(4℃,5 000 r/min)。移取上清液1 mL,加入一定量無(wú)水硫酸鈉,0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾[10-11]。每個(gè)處理15株,3次重復(fù)。

1.3.2 番茄根系次生代謝物質(zhì)的GC-MS分析

采用美國(guó)Varian 300-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。氣相色譜條件:VF-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱溫:50℃保持2 min,之后以5℃/min的速率升溫至290℃,保持15 min,載氣:He,進(jìn)樣溫度:250℃,進(jìn)樣量:1 μL,分流比2;質(zhì)譜條件:EI(電子轟擊):70 eV,倍增器電壓1 250 V,掃描質(zhì)量范圍(m/z)45～500。通過(guò)譜圖庫(kù)檢索鑒定化合物,采用總離子流色譜峰的峰面積歸一化法計(jì)算各種成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MG防治番茄青枯病的物理作用方式

表1中MG擴(kuò)散作用測(cè)定結(jié)果顯示,當(dāng)MG的濃度分別為10 μg/mL和20 μg/mL時(shí),施用MG 24 h或者48 h的各處理的防治效果均在80%以上,且各處理之間的差異不顯著,這說(shuō)明MG有快速擴(kuò)散作用。在測(cè)定MG向頂輸導(dǎo)作用的試驗(yàn)中,MG濃度為20 μg/mL的植株發(fā)病率為60%,即使MG濃度提高10倍,植株發(fā)病率仍達(dá)到56.67%,對(duì)照植株的發(fā)病率為66.67%,三者之間差異未達(dá)到顯著水平(表1),這表明MG的向頂輸導(dǎo)作用很弱。向基輸導(dǎo)作用的測(cè)定試驗(yàn)中,20、200 μg/mL的MG處理以及對(duì)照植株發(fā)病率分別為63.33%、58.33%和65%,施藥與不施藥處理差異不顯著(表1),由此說(shuō)明MG向基輸導(dǎo)作用很弱。

另外從表1可以看出,MG處理番茄后,在間隔不同時(shí)間接種的植株,其發(fā)病情況有所不同。隨著間隔時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)病植株有所增加。接種30 d后調(diào)查植株發(fā)病情況,MG處理當(dāng)天和間隔5 d后接種植株的發(fā)病率較低,分別為6.67%和3.33%;MG處理后10 d和15 d后接種的植株發(fā)病率基本一致,分別為23.33%和25%;MG處理后20 d接種,植株發(fā)病率為40%,CK的發(fā)病率為51.67%。由此推測(cè)MG在溫室條件下的持效期可達(dá)到15 d,并且對(duì)控制番茄青枯病有較好的預(yù)防作用。當(dāng)番茄先接種青枯病菌5 d后再施用MG,防治效果僅為13.03%,這說(shuō)明MG對(duì)番茄青枯病的治療作用很差,因此,MG主要是作為預(yù)防保護(hù)劑對(duì)番茄青枯病起作用的。

表1 MG防治番茄青枯病的物理作用方式1)

1) 每列數(shù)字后不同小寫(xiě)字母表示同一測(cè)定項(xiàng)目?jī)?nèi)不同處理間數(shù)據(jù)達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

Data in the same column followed by different letters indicate significant difference between the data of the same action mode (P<0.05).

2.2 MG對(duì)番茄根系次生代謝的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。在鑒定出的36種化合物中,苯甲醇、水楊酸甲酯、棕櫚酸、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯、硬脂酸、2,2-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、鄰苯二甲酸二異辛酯、維生素E、豆甾醇、β-谷甾醇以及Cholest-5-en-3-ol,24-propylidene-,(3beta)等11種化合物在所有處理的番茄根系中均被檢測(cè)到。番茄根系在不同發(fā)育階段次生代謝產(chǎn)物差異較明顯,與苗期相比,成熟期的化合物減少了12種,新增了8種。另外,十五烷和木栓酮只存在于育苗期施用MG的處理中,芐基肼、蔗糖、乙酸環(huán)阿屯酯3種化合物僅存在于移栽后施用MG的番茄根系中。

表2所列36種化合物中,目前已知具有抑菌殺菌生物活性的物質(zhì)有豆甾醇[12-13]、β-谷甾醇[14]、香葉醇[15-16]以及木栓酮[14,17]等4種。4個(gè)處理中都含有豆甾醇和β-谷甾醇,均表現(xiàn)為施用MG后的含量明顯增多。對(duì)于豆甾醇,育苗期和移栽后施用MG的處理組其含量分別為17.09%和8.78%,與對(duì)照組相比,分別增加了45.45%和68.85%;對(duì)于β-谷甾醇,育苗期和移栽后施用MG的處理組其含量分別為5.3%和6.13%,與對(duì)照組相比,分別增加了133.84%和156.78%。番茄育苗期對(duì)照組和MG處理組均未檢測(cè)到香葉醇,移栽后MG處理組香葉醇含量為6.27%,為對(duì)照組的162.44%。木栓酮為育苗期MG處理組番茄根系中新增的化合物,但在移栽后的MG處理組及對(duì)照組中均未檢測(cè)到。

對(duì)照和MG處理間物質(zhì)含量差別較大的次生代謝產(chǎn)物還有己內(nèi)酰胺、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯、亞麻酸、苯甲醇和水楊酸甲酯。前3種化合物均表現(xiàn)為MG處理后含量明顯降低,苯甲醇和水楊酸甲酯則表現(xiàn)為在苗期MG處理中含量降低而在成熟期MG處理中含量升高。

表2 MG處理下番茄根系次生代謝物質(zhì)的組成及含量

續(xù)表2 Table 2(Continued)

化學(xué)物質(zhì)Compound次生代謝物質(zhì)含量/% Contentofsecondarymetabolites苗期SeedlingstageCKMG處理MGtreatment成熟期MatureperiodCKMG處理MGtreatment維生素EVitaminE0．211．330．261．97三十二烷Dotriacontane1．371．72--豆甾醇Stigmasterol11．7517．095．208．78三十三烷T(mén)ritriacontane7．688．34--β?谷甾醇β?Sitosterol3．965．303．916．13Cholest?5?en?3?ol，24?propylidene?，(3β)2．283．221．351．72木栓酮Friedelan?3?one-1．68--乙酸環(huán)阿屯酯9，19?Cyclolanost?24?en?3?ol，acetate---0．89

3 結(jié)論與討論

在病害防治中,明確一種藥劑的作用方式能夠指導(dǎo)該藥劑的科學(xué)施用,包括恰當(dāng)?shù)氖┯脮r(shí)期、正確的施用部位和使用方式等,對(duì)于提高該藥劑的防治效果至關(guān)重要。根據(jù)本研究的結(jié)果,3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(MG)對(duì)番茄青枯病的預(yù)防效果比較理想,但在番茄植株內(nèi)的向頂和向基的輸導(dǎo)作用很差,治療作用比較弱。另外, MG雖然可被番茄植株根系和根莖部組織快速吸收,但據(jù)推測(cè)屬于短距離的被動(dòng)擴(kuò)散,即便MG在番茄植株上有較長(zhǎng)的持效期,如果病菌侵入器官距離植株施用藥液的部位較遠(yuǎn)時(shí),藥劑也很難達(dá)到有效的防治效果。基于此,在用MG控制番茄青枯病時(shí),應(yīng)當(dāng)在病菌侵入寄主植物前或剛剛侵入到寄主植物的表皮器官時(shí)施用,且藥液盡可能分布到病菌易侵染的寄主組織表面。

植物次生代謝并非生物體或細(xì)胞生長(zhǎng)所必需,是植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,目前已發(fā)現(xiàn)生物堿、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、醌類(lèi)、萜類(lèi)、單寧、苯丙素類(lèi)和甙類(lèi)等多種次生代謝產(chǎn)物在植物抗各種病原的過(guò)程中起作用[18]。還有些次生代謝產(chǎn)物是在病菌或其他因子的誘導(dǎo)作用下植物體內(nèi)新合成的物質(zhì),屬于誘導(dǎo)型次生產(chǎn)物,其中就包括植保素[19]。本研究中,在MG作用下,番茄根系次生代謝物質(zhì)成分與對(duì)照相比有較大變化,體現(xiàn)在代謝物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量上。其中,含量變化明顯的苯甲醇、己內(nèi)酰胺、順式-11,14-二十碳二烯酸甲酯和亞麻酸等物質(zhì)在植物體內(nèi)的作用尚未知曉,而香葉醇、豆甾醇、β-谷甾醇和木栓醇是具有抑菌殺菌生物活性作用或參與植物抗逆抗病的重要物質(zhì),香葉醇還可通過(guò)目標(biāo)外排機(jī)制恢復(fù)一些革蘭氏陰性菌株的藥物敏感性[12-17],后4種物質(zhì)在MG作用后的植株體內(nèi)表現(xiàn)為新增或含量顯著升高。推測(cè)MG能夠誘導(dǎo)番茄根系次生代謝途徑發(fā)生改變,從而導(dǎo)致根系次生代謝物質(zhì)成分變化。但是從MG的物理作用方式測(cè)定結(jié)果來(lái)看,本論文中MG的使用濃度或方法所起到的誘導(dǎo)作用有限,使得番茄中具有抑菌活性或誘導(dǎo)抗性的物質(zhì)含量過(guò)低,無(wú)法從根本上抵御青枯菌的侵染,需要MG直接作用于病菌才能阻止或減輕青枯病的發(fā)生。這些物質(zhì)在種類(lèi)和含量上的變化可能與MG的處理方法密切相關(guān)。今后將進(jìn)一步探討MG是否有誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生抗病性的作用,而且,含量變化明顯的這些物質(zhì)對(duì)番茄植株的生理活性功能以及對(duì)茄青枯拉爾氏菌的抑菌活性也值得深入研究,有可能為應(yīng)用MG防治植物青枯病提供新的思路。另外,水楊酸甲酯是植物體內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì),廣泛參與植物多種代謝過(guò)程,在植物的抗逆反應(yīng)中具有重要作用,其中包括在植物誘導(dǎo)抗病性以及系統(tǒng)獲得抗病性過(guò)程中起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[20]。番茄育苗期含有較多水楊酸甲酯(8.08%),但到成熟期含量顯著下降,僅為1.53%,MG作用于番茄后在苗期降低了水楊酸甲酯的含量,而在成熟期又有所促進(jìn)。造成該化合物含量變化的原因和由此產(chǎn)生的功能尚不清晰,均有待后續(xù)研究。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Physical modes of action of methyl gallate for controlling tomato bacterial wilt and its effect on secondary metabolites of tomato roots

Yuan Gaoqing, Chen Yuanyuan, Fan Wanwan, Li Qiqin, Lin Wei

(College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China)

The physical modes of action of methyl gallate (MG) for controlling tomato bacterial wilt were determined by biological method, and its effect on secondary metabolites of tomato roots was determined by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method. The results showed that methyl gallate could effectively protect tomato from tomato bacterial wilt with a long lasting period. When methyl gallate was applied 15 d before the pathogen was inoculated, the control efficacy could reach 52.12%. Methyl gallate could diffuse quickly towards tomato root tissues; however, the compound was difficult to translocate from bottom to top or reversed. A total of 36 secondary metabolites produced from tomato roots were identified. Compared with the contrast, the categories and relative contents of root secondary metabolites under the MG treatment were obviously changed. Four of them were relevant to antimicrobial activity, which were geraniol, stigmasterol,β-sitosterol and friedelinol, and the first three were significantly increased and friedelinol was a new compound in seedling roots under the MG treatment.

methyl gallate; tomato bacterial wilt; physical mode of action; secondary metabolite

2015-12-21

2016-02-15

廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFAA019056)

S 436.412

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.013

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